1. 서 론

피부는 1.8 m²의 면적을 가지는 신체에서 가장 큰 기관으로 환경오염 물질이나 약품, 자외선 등 외부 자극물질로부터 체내를 보호하는 역할 을 하며 다양한 미생물이 서식할 수 있는 환경을 갖추고 있다[1]. 피부에 는 피부 상재균이 존재하는데 Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli 등이 대표적이며 이들은 주위의 환경과 잘못 된 생활 습관 등으로 인해 독성이 강한 물질을 분해하여 피부의 염증 을 초래하는 원인균으로 작용하게 되고[2] 여드름, 비듬 및 아토피와 같은 피부 질환을 유발할 수 있다. 또한 피부 상재균은 화장품의 오염 을 초래하기도 한다. 따라서 화장품 분야에서는 피부 상재균 및 기타 세균에 의한 화장품의 오염을 방지하기 위해 메틸파라벤과 같은 방부 제가 사용되고 있으나 최근 파라벤류나 페녹시에탄올과 같은 합성 방 부제의 안전성 문제가 제기되면서 이를 대체할 수 있는 천연 방부제 에 대한 개발이 중요시 되고 있다[3-5].

미생물 외에도 일상생활 중에 많이 노출되는 자외선은 피부에 산화 적 스트레스를 유발하고 노화를 가속화시킨다. 자외선에 노출된 피부 에서는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되고 단백질 의 산화, DNA 손상, 지질 과산화 반응을 개시시킨다. 더욱이 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현이 촉진되어 콜라겐, 엘라스틴 섬유 의 절단 및 비정상적인 교차결합을 일으키게 된다[6-8]. 이러한 손상 을 방지하기 위해 피부에는 효소적 항산화제나 비효소적 항산화제와 같은 항산화 방어망이 구축되어 있으나 피부의 항산화 방어 수준을 압도하는 과잉의 ROS는 체내 항산화 네트워크의 균형을 깨뜨려 결국 피부 노화 및 여러 질병을 유발하게 된다[9]. 그러므로 자외선으로부 터의 피부 세포 보호 및 광노화 예방을 위해서는 항산화제의 적절한 보충이 꼭 필요하다. 인위적으로 보충이 가능한 항산화제는 크게 합 성 항산화제와 천연 항산화제로 나눌 수 있는데, butylated hydroxyanisole (BHA) 및 butylated hydroxytoluene (BHT)과 같은 합성 항산 화제들은 가격이 저렴하고 항산화 효과가 뛰어나 널리 이용되고 있지 만 암을 유발하는 등 안전성에 대한 우려가 있어 최근에는 비교적 부 작용이 적은 천연물로부터 천연 항산화제를 찾아내려는 연구들이 활 발히 이루어지고 있다[10-11]. 한편, 식물유래 천연 항산화제 중 페놀 성 화합물, 특히 폴리페놀의 일종인 플라보노이드는 지질의 산화 및 ROS로 유발되는 산화적 스트레스를 억제하여 노화를 방지하며 암을 예방하는 것으로 알려져 많은 연구가 수행되고 있으며 식품, 의약품 및 화장품 등의 소재로도 다양하게 활용되고 있다[12-14].

자소엽(Perilla frutescens var. acuta)은 차조기 또는 주름소엽이라 불리는 인도, 중국, 일본, 베트남 및 한국과 같은 아시아 국가에서 주 로 재배되는 꿀풀과의 한해살이풀로서, 예로부터 한방에서는 천식, 기 침, 가래, 인후염, 소화불량, 요통, 불면증, 당뇨병 등의 처방에 이용되 어 왔다[15-17]. 전통약용 식물로서 광범위한 분야에서 효능을 나타내 는 자소엽은 항산화, 항염증 및 항노화 등의 효과가 나타나는 것으로 보고되었다[18-21]. 하지만 화장품 소재로의 적용을 위한 자외선에 대 한 세포보호효과나 각종 ROS(H₂O₂, O₂^⋅-, ⋅OH)가 생성되는 계에서 이들 ROS에 대한 총 항산화능에 대해서는 아직 연구가 되어 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 자소엽 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이 트 분획을 제조하여 UVB 및 ROS로 유발되는 세포손상에 대한 보호 작용, 총 항산화능 및 free radical 소거능을 비교 평가하였으며 피부 상재균에 대한 항균 효과를 평가하고 활성 성분을 조사함으로써 화장 품에 기능성 소재로 응용 가능성이 있는지를 알아보고자 하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. 실험재료

본 연구에서 사용된 자소엽은 농업회사법인 주식회사 두손애약초 (경북 영천시)에서 구매하였다.

2.2. 기기 및 시약

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성 실험에 사 용된 UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, Luminol 화학발광실험에서 사용되는 화학발광기는 Berthold (Germany) 사의 6-channel LB9505 LT를 사용하였다. Microplate reader는 Tecan (Austria)사의 제품을 사용하였다. HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 Shim-pack GIS ODS-I C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)을 사용 하였다. LC/ESI-MS (Applied Biosystems, USA)는 서울대학교 NICEM (농생명과학공동기기원)에 분석 의뢰 하였다.

DPPH radical, luminol, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), H₂O₂, 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT), (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), FeCl₃⋅6H₂O 및 L-ascorbic acid는 Sigma Chemical Co. (USA)의 제품을 사용하였고, 에탄올 (EtOH) 및 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 시약과 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin (P/S) 및 trypsin 등은 Capricorn Scientific (Germany) 제품을 사용하였 다. 성분 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet gel 60 F₂₅₄ (0.2 mm)로 Merck (USA)에서 구입하였다.

2.3. 자소엽의 추출/분획 및 수율

실험에 사용된 자소엽의 추출 및 분획은 Figure 1과 같은 방법으로 이루어졌다. 건조된 자소엽 150 g을 50% 에탄올 3 L에 5개월 동안 상온에서 침적시켜 추출한 후 여과하였으며 여액을 감압 농축하여 50% 에탄올 추출물 파우더를 얻었다. 남은 50% 에탄올 추출물은 감 압 증류하여 수층만 남기고 헥세인으로 5회 분획하여 엽록소 등의 비 극성 성분을 제거 후 에틸아세테이트로 3회 분획하여 감압 농축하고 에틸아세테이트 분획 파우더를 얻었다. 수율은 자소엽 건조 중량(150 g) 을 기준으로 계산되었으며 50% 에탄올 추출물은 13.0, 50% 에탄올 추출물로부터 얻어진 에틸아세테이트 분획의 수율은 0.9%이었다.

2.4. 항균 활성 평가

항균 활성 평가에 사용된 균주로 Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 23736, Pseudomonas aeruginosa ATCC 29336 및 Candida albicans ATCC 10231을 한국미생물보존센터 (KCCM, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 모든 균주는 tryptic soy agar (Merck)에 동결시켜 놓은 균을 도말한 후 37 ℃에서 24 h 배양시킨 후 실험에 사용하였다.

자소엽 50% 에탄올 추출물 및 분획의 항균활성을 알아보기 위해 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 각 균주들은 0.85% NaCl에 현탁시켜 10배 희석을 통해 균수를 세어 1-5 × 10⁶ CFU/mL를 실험에 사용하였고 희석된 최종농도가 1-5 × 105 CFU/mL가 되도록 하였다. 96-well plate의 한 well당 추출물 20 μL, 균주 20 μL, broth 160 μL로 총 200 μL가 되도록 하였다. 각 시료 는 DMSO에 녹여 두 배 희석법을 이용해 최종 농도가 10,000, 5,000, 2,500, 1,250, 625, 312, 156, 78 μg/mL가 되도록 하였으며 대조군으로 는 화장품 방부제인 메틸파라벤을 사용하였다. 30 ℃에서 18-24 h 배 양 후 육안으로 관찰하였을 때 균이 콜로니 형태로 자라거나 자라지 않은 농도를 MIC 값으로 결정하였고 완전히 자라지 않는 농도를 최 소사멸농도(minimum bactericidal concentration, MBC)로 결정하였다. 배양 후 육안으로 확인되지 않는 well은 한천배지에 면봉으로 도말하 여 MIC와 MBC를 결정하였다.

2.5. 항산화 활성 평가

2.5.1. DPPH법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거능 측정은 시료 내의 항산화 물질과 자유 라디칼 인 DPPH 시약이 반응하여 시료의 항산화 작용에 의한 자유 라디칼 소거능에 따라 보라색이 노란색으로 변하는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법이다. 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 1 mL 에 에탄올 1 mL를 첨가한 후 측정할 시료 1 mL를 첨가하여 섞어준 뒤 10 min 간 상온 방치시킨 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control)은 시료가 포함되지 않은 용매를 첨가한 것으로, 이때 DPPH 라디칼은 최대 흡광도를 나타낸다. 실험군(experiment)은 시료를 첨가한 것으로, 시료에 의해 DPPH가 환 원될 경우 517 nm에서의 흡광도가 감소하게 된다. 시료 바탕실험군 (sample blank)은 DPPH를 첨가하지 않고 시료만을 첨가한 것으로, 시 료자체의 흡광도를 나타낸다. 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH 라디칼 이 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity concentration, FSC₅₀, μg/mL)로 표기하였으며, 각각의 흡광도(A)로 부터 다음 식 (1)에 의해 DPPH 라디칼 소거 활성(%)을 구하였다.

2.5.2. 루미놀 화학발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에 있어서 활성산소 소거 활성(총 항산화능)

화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.78 mL를 넣고 여러 농도의 자소 엽 50% 에탄올 추출물 및 분획을 넣는다. 여기에 2.5 mM EDTA 40 μL 및 5 mM FeCl₃⋅6H₂O 10 μL를 가한 후 35 mM 루미놀 80 μL를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5 min 동안 항온 반응 시킨 후 150 mM H₂O₂ 40 μL를 넣고 25 min 동안 화학발광을 측정하였다. 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 실험군(experiment)과 조건이 동일하 나 H₂O₂와 FeCl₃⋅6H₂O 대신 증류수를 첨가하였다. 활성산소 소거 활성의 크기는 화학발광의 세기(counts per minute, CPM)가 50% 감소 되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity concentration, OSC₅₀, μg/mL)로 표기하였으며 다음 식 (2)에 의해 ROS 소거 활성(%)을 구하였다.

2.6. HaCaT 세포를 이용한 세포보호효과 평가

2.6.1. 세포배양

각질 형성 세포인 HaCaT 세포주는 CLS Cell Line Service GmbH (Eppelheim, Germany)에서 얻어 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (P/S)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium으로 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

2.6.2. 세포독성 평가

자소엽 50% 에탄올 추출물 및 분획이 각질 형성 세포인 HaCaT 세 포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 이용하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 먼저 세포를 96-well plate에 1 × 10⁴ cells/well로 분주하여 60-80% confluence에 도달할 때 까지 배양하였다. 이후 무혈청 배지에 자소엽 50% 에탄올 추출물 및 분획을 희석하여 각각 농도별로 처리하고 24 h 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 모두 제거하고 0.5 mg/mL MTT용 액을 각 well에 첨가하여 인큐베이터에서 2 h 동안 formazan을 생성시 켰다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹이고 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.6.3. 세포 내 ROS 소거 활성

세포 내 ROS 소거 활성 평가는 2ʹ,7ʹ-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이 용하였다. 세포를 96-well black plate에 1 × 10⁴ cells/well의 농도로 분 주하여 24 h 동안 배양한 후, Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)를 이용하여 1회 세척하였다. 그 후 DPBS에 녹인 20 μM 농도 의 DCFH-DA를 30 min 동안 처리하고 DPBS를 이용하여 세포를 3회 세척하였다. CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에 서 400 mJ/cm²의 UVB를 조사하여 세포 내 ROS를 생성시킨 후, 샘플 을 농도별로 처리하고 fluorescence microplate reader (excitation: 490 nm, emission: 530 nm) 기기를 통하여 형광의 세기를 측정하였다.

2.6.4. UVB로 유도된 세포 손상에 대한 세포보호효과

세포 배양기에서 70-80% 정도까지 배양한 HaCaT 세포를 세포배양 액을 제거한 후 DPBS 이용하여 세포를 세척하였다. 이후 DPBS 상태 에서 400 mJ/cm² 조사량의 UVB를 조사하여 세포손상을 유도하였다. 조사 후, 남아있는 DPBS를 제거하고 농도별 자소엽 에탄올 추출물과 분획을 포함하는 무혈청 DMEM 배지로 교체한 다음 37 ℃ 배양기에 서 배양하였다. 24 h 후 MTT assay를 통해 세포생존율을 확인하여 UVB로 유도된 세포손상에 대한 자소엽 추출물 및 분획의 세포보호 효과를 확인하였다[22].

2.7. 총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 측정

자소엽 50% 에탄올 추출물 및 분획 중의 총 페놀성 화합물 함량 측정은 Alves 등의 방법[23]을 이용하였다. 시료의 최종농도가 100 μg/mL 및 25 μg/mL가 되도록 증류수에 녹여 희석하였으며, 희석된 시료 80 μL에 Folin-Ciocalteu 시약(50% v/v) 20 μL를 가하여 25 ℃에 서 5 min 동안 반응시켰다. 여기에 포화 Na₂CO₃용액(2% w/v) 200 μL 를 가하여 혼합하고 25 ℃에서 30 min간 반응시킨 후 microplate reader 로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffeic acid를 표준물질로 하여 농도별(0-50 μg/mL) 표준곡선을 작성한 후 총 페놀성 화합물 함량을 구하였다.

총 플라보노이드 함량 측정은 Rebaya 등의 방법[24]을 수정하여 시 행하였다. 시료의 최종농도가 500 μg/mL 및 62.5 μg/mL가 되도록 에 탄올에 녹여 희석하였으며, 희석된 시료 12.5 μL에 포화 NaNO₂ 용액 (5% w/v) 7.5 μL를 넣고 25 ℃에서 6 min 동안 반응시켰다. 여기에 포화 AlCl3 용액 (10% w/v) 15 μL를 가하여 혼합하고 25 μ에서 5 min 동안 반응시킨 후 1 M NaOH 75 μL 및 증류수 140 μL를 넣고 15 min 동안 25 ℃에서 반응시킨다. 이후 microplate reader로 510 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Luteolin을 표준물질로 하여 농도별(0-100 μg/mL) 표준곡선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

2.8. 자소엽 추출물의 성분 분석

2.8.1. TLC를 이용한 성분 분석

자소엽 추출물의 성분 분석은 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이 트 분획을 사용하여 이루어졌다. 50% 에탄올 추출물 파우더를 50% 에탄올, 에틸아세테이트 분획 파우더를 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millipore 0.45 μm)를 이용하여 여과시키고 그 여액으로 TLC 및 HPLC 분석을 진행하였다. TLC 분석 시 사용한 전개 용매는 상대적으로 비극성인 플라보노이드의 분석을 위해 hexane : ethyl acetate : acetic acid : = 24 : 14 : 5 (v/v) 조건을 사용하였다. 성분 확인은 기존에 알려진 분광학적 자료와 플라보노이드 표준물질의 R_f 값과 자 외선 및 NP (2-aminoethyl diphenylborinate) 발색법을 이용한 띠의 색 상 등을 통해 확인하였다.

2.8.2. HPLC 및 LC/ESI-MS를 이용한 성분 분석

TLC로 분리된 각각의 띠를 긁은 후 100% 에탄올 추출, 여과한 뒤 감압 농축하여 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millipore 0.45 μm)를 이용하여 여과하고 그 여액을 HPLC, LC/ESI-MS 분석에 이용 하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 용매(phase A)와 0.5% acetic acid를 함유한 50% acetonitrile 용매(phase B)를 이용하여 기울기 용 리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 Table 1에 나타내었다. LC/ESI-MS를 이용한 성분 분석에서 LC기기는 Thermo-Finnigan Surveyor Instrument (Thermo Scientific, USA)(column spec. U-VDSpher Pur C18-E 1.8 μm, 50 × 2.0 mm Cat-No. N0520E181UVC), autosampler, PDA-UV detector를 사용하였으며, 질량분석(mass spectrometric analysis)기기는 Thermo Finnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface (Thermo Scientific, USA)를 사용하였 다. Injection volume은 5 μL, flow rate는 200 μL/min이며 전개용매 조 건으로는 0.1% formic acid (in D.W) (phase A) : 0.1% formic acid (in acetonitrile) (phase B) = 75 : 25를 사용하였다.

2.9. 통계처리

본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 통계자료의 값은 mean ± S.D.로 표시하였다. 통계적 유의성 검증은 Graphpad Prism 5.0 (San Diego, CA) 프로그램을 이용하였으며, one-way ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 자소엽 추출물의 항균 활성

자소엽 추출물에 대한 항균 활성은 화장품의 방부력 평가를 위해 대표적으로 사용되는 호기성 그람 양성 세균인 S. aureus, 호기성 그 람 음성 세균인 P. aeruginosa, E. coli 및 효모균인 C. albicans 총 4종 의 균주에 대하여 최소 저해 농도(MIC)를 측정하였으며 측정 결과는 Table 2에 나타내었다. S. aureus에서 자소엽 50% 에탄올 추출물은 1,250 μg/mL, 에틸아세테이트 분획은 78 μg/mL로 MIC가 나타났으며 대조군으로 사용된 메틸파라벤(2,500 μg/mL)보다 높은 항균활성을 나 타내었다. P. aeruginosa에서 MIC 값은 50% 에탄올 추출물은 1,250 μg/mL, 에틸아세테이트 분획은 78 μg/mL로 나타나 대조군(1,250 μg/mL)과 같거나 더 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 그 밖에 도 E. coli와 C. albicans에서 50% 에탄올 추출물은 각각 10,000 μg/mL, 에틸아세테이트 분획은 각각 1,250 μg/mL로 MIC가 나타남을 확인하였고 메틸파라벤과 유사하거나 낮은 활성을 보였다. MIC를 통 해 자소엽 추출물 및 분획의 항균활성을 확인한 결과 그람 양성, 음성 균과 효모균 모두에서 항균활성이 나타남을 확인하였고, 특히 자소엽 의 에틸아세테이트 분획은 아토피를 일으키는 S. aureus와 모낭염의 원인균인 P. aeruginosa에서 뛰어난 항균활성을 나타내어 자소엽 추 출물이 천연 방부제뿐만 아니라 아토피 개선용 화장품 소재로써 응용 될 수 있을 것이라 예상된다.

3.2. 자소엽 추출물의 항산화 활성

3.2.1. DPPH 자유 라디칼 소거 활성

짝을 짓지 않은 홀 전자를 갖고 있는 자유 라디칼은 불안정하고 매 우 큰 반응성을 갖는다. 자유 라디칼의 이러한 큰 반응성은 피부뿐만 아니라 생체 구성 성분들에도 손상을 준다. 일반적으로 반응성이 커 서 불안정한 라디칼과는 달리 DPPH 라디칼은 질소라디칼 주위에 3개 의 벤젠고리가 존재하기 때문에 라디칼 전자가 컨쥬게이션된 p 오비 탈에 비편재화 되어 비교적 안정한 구조를 형성한다. DPPH 라디칼의 최대흡수파장(λ_max)은 517 nm로 짙은 보라색을 띠며, 항산화 성분과 반응하게 되면 수소 원자를 받아 환원되어 517 nm 파장의 흡광도는 사라지고 보라색이 노란색으로 변하게 되는 특성이 있어 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질의 전자공여능을 측정하는데 많이 이용되고 있다[9]. 자소엽 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획의 농도 별 DPPH 라디칼 소거 활성을 관찰한 결과는 Table 3과 같고 양성대 조군으로는 지용성 항산화제로 널리 알려진 (+)-α-tocopherol을 사용 하였다. 자소엽 추출물 및 분획 모두에서 농도 의존적으로 DPPH 라 디칼 소거 활성이 증가하였으며 각 농도에서 에틸아세테이트 분획이 높은 자유 라디칼 소거 활성을 보였다. 50% 에탄올 추출물의 경우 25 μg/mL부터 200 μg/mL까지 3.45-88.28%의 라디칼 소거 효과를 보였 으며, 12.5 μg/mL에서는 소거 효과를 보이지 않았다. 에틸아세테이트 분획의 경우 12.5 μg/mL부터 200 μg/mL까지 31.28-86.98%의 라디칼 소거 효과를 보였고 에탄올 추출물보다 높은 활성을 보였다(Table 3). 또한 DPPH 자유 라디칼이 50% 소거되는 농도인 FSC₅₀은 50% 에탄 올 추출물이 104.15 μg/mL, 에틸아세테이트 분획이 25.90 μg/mL로 나타나 에틸아세테이트 분획이 에탄올 추출물 보다 약 4배 정도 높은 활성을 가짐을 알 수 있었다. 하지만 비교물질로 사용한 (+)-α -tocopherol의 FSC₅₀은 8.55 μg/mL로 추출물 및 분획이 대조군보다는 낮은 활성을 보임을 확인하였다(Figure 2).

3.2.2. 루미놀 화학발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에 있어서 활성산소 소거 활성(총 항산화능)

Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서는 Fe³⁺와 H₂O₂에 의해 Fenton 반응이 일어 난다. 이러한 계에서는 ¹O₂을 제외한 대부분의 활성산소종(O₂^⋅-, ⋅OH, H₂O₂)이 생성되고 존재한다. 이 계에서 철과 같은 전이금속은 반응성 이 매우 큰 ⋅OH를 생성시키는데 중요한 역할을 한다. ROS에 의해 산화된 루미놀은 들뜬 상태의 아미노프탈산으로 전환되며, 다시 바닥 상태로 떨어지면서 420-450 nm에서 빛을 방출한다. 항산화제에 의해 ROS가 소거되면 루미놀이 아미노프탈산으로 전환되는 양이 감소하 며 따라서 화학발광이 감소하게 된다[25]. 실험 결과, 50% 에탄올 추 출물의 경우 1.50 μg/mL부터 10.00 μg/mL까지 3.04-62.39%의 총 항 산화능을 보였으며 에틸아세테이트 분획의 경우 1.25 μg/mL부터 10.00 μg/mL까지 34.77-97.63%의 총 항산화능을 보였다(Table 4). 또 한 ROS가 50% 소거되는 농도인 OSC₅₀은 50% 에탄올 추출물이 8.67 μg/mL, 에틸아세테이트 분획이 1.40 μg/mL를 나타내어 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분획이 약 6배 높은 활성을 보였다. 양성 대조군으로는 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid를 사용하였으며 1.25 μg/mL부터 10.00 μg/mL까지 13.42-75.50%의 총 항산화능을 보 였고 OSC₅₀은 5.94 μg/mL로 나타났다(Figure 3, Table 4). 에틸아세테 이트 분획은 양성 대조군으로 사용한 L-ascorbic acid 보다도 약 4배 정도 높은 활성을 나타내었으며 통계적으로도 유의하게 높은 활성산 소 소거 활성을 보임을 확인하였다.

3.3. 자소엽 추출물의 HaCaT 세포에 대한 세포보호효과

3.3.1. 세포 독성 평가

MTT assay를 통해 자소엽 추출물의 HaCaT 세포에 대한 독성 평가 를 평가함으로써 앞으로의 항산화 효능 평가를 위한 샘플의 농도 범 위를 결정하였다. 이에 따라 0.25-64.0 μg/mL 농도의 자소엽 50% 에 탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획을 HaCaT 세포에 24 h 처리 후 세포생존율을 확인하였다. 샘플을 처리하지 않은 NC (negative control) 군과 비교하였을 때 50% 에탄올 추출물은 모든 범위에서 80% 이상의 세포생존율을 보였고 최고농도인 64.0 μg/mL에서는 80.5%의 생존율 을 보였다. 에틸아세테이트 분획은 최고농도인 64.0 μg/mL를 제외한 모든 농도에서 80% 이상의 세포생존율을 보였으며 32.0 μg/mL에서 84.1%의 생존율을 보였다(Figure 4). 본 실험에서는 자소엽 추출물 및 분획의 항산화 활성을 평가하기 위해 모든 샘플에서 80% 이상의 생 존율을 보인 32.0 μg/mL를 최고 농도로 설정하였다.

3.3.2. 세포 내 ROS 소거 활성

최외각 방어망인 표피에 자외선을 처리하면 세포 내에서는 ROS가 생성된다. 생성된 ROS는 세포 내에서 산화반응을 일으키며 지질 과 산화반응, 막 단백질 손상 및 DNA 변형을 일으킬 수 있다[26]. 또한, 콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외 기질을 분해시키는 MMPs의 발현을 촉진시켜 피부 노화를 가속화시킨다. 따라서 세포 내에 발생한 ROS 를 소거할 수 있는 항산화 물질은 피부 노화를 억제할 수 있다. 본 연 구에서는 HaCaT 세포를 이용하여 자소엽 추출물 및 분획의 세포 내 ROS 소거 활성을 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군(PC 군)은 조사하지 않은 군(100%)에 비하여 ROS 생성 수준이 1.7배 증 가하였다. 자소엽 추출물 및 분획을 HaCaT 세포에 0.5-32.0 μg/mL 농 도로 24 h 동안 처리하였을 때, 모두 농도 의존적으로 ROS가 감소함 을 보였다(Figure 5). 에탄올 추출물의 경우 PC군에 비해 8 μg/mL 이 상에서 유의적 감소를 나타냈으며, 각각 PC군 대비 16.1, 19.6 및 28.6%의 감소율을 나타냈다. 에틸아세테이트 분획은 4 μg/mL 이상에 서 유의적 감소를 나타냈으며, 각각 PC군 대비 28.6, 30.9, 37.3 및 40.7%의 감소율을 나타냈다. 이상의 결과로 자소엽 50% 에탄올 추출 물보다 에틸아세테이트 분획이 세포 내 ROS 소거 활성이 뛰어남을 확인하였다.

3.3.3. UVB로 유도된 HaCaT 세포 손상에 대한 세포보호효과

자외선은 파장에 따라 UVC (100-280 nm), UVB (280-320 nm), UVA (320-400 nm)로 구분되며 그중 UVB와 UVA가 지표면에 도달 하여 피부 세포에 영향을 끼친다. 특히, UVB는 사람 피부 세포에서 직접적인 DNA 손상에 기여하며 피리미딘 다이머 등의 비정상적인 공유 결합을 형성하여 피부 세포 손상 및 피부 노화를 가속화시킨다 고 알려져 있다[27]. 본 연구에서는 UVB 조사량을 400 mJ/cm²로 하 여 HaCaT 세포에 산화적 손상을 유발하고 자소엽 추출물 및 분획의 세포보호효과를 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군(PC군) 은 조사하지 않은 군(100%)에 비하여 18.35%의 세포생존율을 나타내 었다. UVB를 조사한 후, 0.25-32.0 μg/mL 농도의 자소엽 추출물 및 분획을 HaCaT 세포에 24 h 동안 처리하였을 때, 에탄올 추출물의 경 우 32.0 μg/mL 농도에서 유의적으로 세포생존율이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, 에틸아세테이트 분획은 2.0-16.0 μg/mL의 농도에서 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다(Figure 6). 즉, 자소엽 50% 에탄올 추출물 보다 에틸아세테이트 분획이 UVB로 유도된 세포 손상에 대한 보호효과가 뛰어남을 확인하였다.

3.4. 총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량

페놀성 화합물 및 플라보노이드는 주로 항산화능을 나타내는 물질 로서 천연물의 항산화력을 결정하는데 중요한 화합물로 알려져 있다. 페놀성 화합물에 존재하는 phenolic hydroxyl기는 단백질 등과 결합하 는 성질을 가지며 항산화, 항암 및 항균 효과 등의 다양한 생리 활성 을 나타낸다[28]. 플라보노이드는 C₆-C₃-C₆를 기본골격으로 하는 페놀 성 화합물의 일종으로, 노란색 또는 담황색을 나타내는 폐놀계 화합 물을 총칭하며[29] 함량이 높을수록 항산화 효과가 높다. 자소엽 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획 1 g당 각각에 포함되어 있는 총 페놀성 및 플라보노이드 함량을 Table 5에 나타내었다. 자소엽 50% 에탄올 추출물과 분획에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 caffeic acid의 양으로 환산하여 표시한 결과, 50% 에탄올 추출물은 61.0 mg/g, 에틸아세테이트 분획은 304.2 mg/g로 나타났다. 총 플라보노이 드 함량은 luteolin의 양으로 환산하여 나타내었으며 50% 에탄올 추출 물은 149.1 mg/g, 에틸아세테이트 분획은 835.8 mg/g으로 나타났다. 총 플라보노이드 함량의 경우 에틸아세테이트 분획에서 에탄올 추출 물 보다 약 6배 정도 높게 나타났다. 이러한 결과를 통해 항균 활성 및 항산화 활성 평가에서 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 분 획이 더 뛰어난 효능을 보인 것은 다량의 페놀성 화합물과 플라보노 이드의 함유에 의한 것임을 확인하였다.

3.5. 자소엽 추출물의 성분분석

자소엽 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획의 성분을 확인 하기 위해, TLC 크로마토그램과 HPLC 및 LC/ESI-MS를 이용하였다. Figure 7은 자소엽 추출물 및 분획의 TLC 크로마토그램을 보여주며 크게 6개의 띠로 분리됨을 확인하였다. 그중 5개의 띠(PFE1-PFE5)를 추출하여 각각에 대해 성분을 확인하였다. 추출한 띠를 이용하여 LC/ESI-MS를 측정하였고 표준물질과 UV-Visible 흡수 스펙트럼 및 HPLC 결과와 참고문헌을 통해 각 성분들을 최종적으로 확인하였다. PFE1은 rosmarinic acid, PFE2는 luteolin, PFE3은 caffeic acid, PFE4 는 apigenin, PFE5는 ethyl caffeate와 일치하였다(Table 6, Figure 7). TLC 크로마토그램에서 분리한 성분들(PFE1-5)과 HPLC 피크들을 비 교한 결과 PFE1은 peak 2 (rosmarinic acid), PFE2는 peak 4 (luteolin), PFE3은 peak 1 (caffeic acid), PFE4는 peak 5 (apigenin), PFE5는 peak 3 (ethyl caffeate)으로 나타났다(Figure 8). 자소엽 50% 에탄올 추출물보 다 에틸아세테이트 분획에서 유효 성분의 함량이 더 높음을 확인하였 으며 에틸아세테이트 분획의 뛰어난 총 항산화능 및 세포 내 활성산 소 소거 활성은 이들의 뛰어난 환원력과 킬레이팅 작용으로부터 기인 했을 것으로 사료된다.

4. 결 론

본 연구에서는 자소엽의 천연화장품 소재로의 응용 가능성을 확인 하기 위해 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획을 제조하여 항균 활성 및 항산화 활성을 평가하고 성분분석을 진행하였다.

피부 상재균을 이용한 항균 활성 평가 결과 자소엽 50% 에탄올 추 출물의 경우 E. coli와 C. ablicans를 제외한 균주에서 대조군인 메틸 파라벤과 유사하거나 높은 활성을 보였고 에틸아세테이트 분획은 모 든 균주에서 대조군과 유사하거나 높은 활성을 보였다. 자소엽 추출 물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성, Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서 의 총 항산화능 및 세포 내 ROS 소거 활성을 통해 평가하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과 50% 에탄올 추출물의 FSC₅₀ 값은 104.15 μg/mL, 에틸아세테이트 분획의 FSC₅₀ 값은 25.90 μg/mL를 나타내었 다. Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서의 총 항산화능 측정 결과 50% 에탄올 추 출물의 OSC₅₀ 값은 8.67 μg/mL, 에틸아세테이트 분획의 OSC₅₀ 값은 1.40 μg/mL를 나타내었고 에틸아세테이트 분획의 경우 대조군인 L-ascorbic acid (OSC₅₀, 5.94 μg/mL)보다 높은 활성을 보였다. HaCaT 세포를 이용한 세포 내 ROS 소거 활성 평가 결과 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획 모두에서 농도 의존적으로 소거 활성을 보였 으며 32.0 μg/mL에서 각각 대조군 대비 28.6 및 40.7%의 감소율을 보 여 가장 높은 소거 활성을 보였다. 또한, UVB에 대한 세포보호효과 실험에서 UVB 조사 후 에틸아세테이트 분획을 HaCaT세포에 처리하 였을 때 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 자소엽 에틸 아세테이트 분획이 총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 측정 결 과에서 50% 에탄올 추출물보다 약 6배 정도 높은 수치를 보였고 TLC 및 HPLC 분석 결과에서도 유효 성분의 함량이 더 높음을 확인하였다. 따라서 자소엽 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물보다 항산 화 및 항균 활성 평가에서 뛰어난 효과를 보인 것으로 사료되며 TLC, HPLC 및 LC-ESI/MS를 이용하여 성분 분석을 진행한 결과 rosmarinic acid, luteolin, caffeic acid, apigenin 및 ethyl caffeate가 주요 성분임을 확인하였다.

최근 화장품 소재로서 친환경적이고 저자극적인 천연 성분에 대한 관심이 높아지면서 그에 대한 연구의 필요성이 증가하고 있다. 본 연 구의 결과를 통해 자소엽 추출물의 뛰어난 항산화 및 항균 효과를 확 인하였으며 식물유래 천연 항산화제 및 방부제로서 응용 가능성이 높 을 것으로 판단된다.