1. 서 론

용액상에서 농도를 측정하는데 있어 저렴하고 효과적이고 간단한 방법은 자외선가시광선분광법으로 알려져 있다[1]. 자외선가시광선분 광법을 이용하는 분야는 바이오, 고분자, 에멀전, 환경 분야, 에너지, 음식 등 다양한 분야에서 사용되고 있다[2-6]. 또한 plasmonic effect를 가지는 금속 나노 입자의 농도와 크기 측정에도 사용되고 나노 입자 를 활용한 촉매 반응에서의 농도 변화를 측정하는데 사용되어 왔다 [7-10]. 나노 입자는 원자와 벌크 입자의 특성과 다른 광학적, 표면전 자 특성을 가지고 있어 촉매 및 광전자 등에 다양하게 사용된다 [11-12]. 따라서 용액상의 촉매 반응이 진행되는 동안 조성의 변화를 측정하는데 자외선가시광선분광법은 효율적이며 빠르고 재현 가능한 분석 방법이며 Beer의 법칙에 따라 시료의 농도를 분석할 수 있다 [13]. 하지만 자외선가시광선분광법의 측정범위는 200~1100 nm의 파 장 범위지만 정확성과 신뢰성을 위해서는 220~780 nm에서 분석을 해 야 하며 극성 용매의 극성 분자와 같이 용매는 상호작용을 하며 스펙 트럼의 분해능을 감소시킨다[14]. 고농도에서 화합물은 이량체 형성, 분해, 응집, 침전 등으로 인해 농도가 증가하면 상호작용 빈도가 증가 하여 이량체가 형성될 수 있어 Beer의 법칙에서 벗어나 비선형 영역 이 나타나 농도를 정확히 측정할 수 없다[14].

색상 분석은 간단하고 빠르게 분석할 수 있으며 단순성과 높은 감 도가 장점이다[15]. 촉매 반응으로 시료의 색이 변할 때 컬러에 따른 농도를 분석하고자 하며 촉매 특성 평가가 목표이다. 현존하는 액상 용액의 농도 분석이 가능한 기기의 한계점까지 극복할 수 있다. 고온 에서 반응과 고농도의 시료 등 극한 상황에서도 적용되며 디지털 이 미지를 통해 컬러 분석이 가능하다. 예를 들어, 포도당 검출에 사용되 는 색상 분석은 15 min 내에 150 개 샘플 분석이 가능하다고 한다[16].

이 연구에서는 색상 분석을 통해 자외선가시광선분광법의 결과와 동 일성을 가지는 유효성에 대해서 검증한다. 색상 분석에 사용되는 색공 간은 RGB, HSV, CIE LCH, CIE L*a*b*, CIE xyY, CIE Yu’v’, CMYK 이고 모두 7가지가 있다. RGB는 빛의 삼원색으로 빨간색, 녹색, 파란색 을 이용하여 색을 표시하는 방법이다. HSV에서 hue (H)는 색상을 나타 내며 0~360 도로 가시광선 스펙트럼을 고리모양으로 배치한 것으로 파 장이 긴 빨강을 0 도로 한다. saturation (S)는 특정 색상의 가장 진한 상 태를 100%로 하며 진하기를 나타낸다. value (V)는 흰색, 빨간색 등을 100%, 검은색을 0%로 하는 밝은 정도를 나타낸다[17]. CIE LCH도 HSV와 마찬가지로 명도, 채도, 색상을 의미한다. CIE L*a*b*는 L는 밝기, a*는 초록(음수)-빨강(양수)을 나타내며 b*는 파랑(음수)-노랑(양 수)로 색상을 표현한다[18]. CIE xyY 중 Y는 밝기, xy는 색도좌표라고 불리는데 계산된 값이다[19]. 색상 분석을 통해 농도 측정하기 위해서 resazurin (RZ)과 resorufin (RF)을 이용하고 반응을 통한 농도 변화는 RZ의 환원반응을 통해 RF가 생성되는 촉매 반응을 이용하였다. RZ와 RF는 각각 파랑색과 붉은색을 띄는 염료로 농도의 변화가 CIE L*a*b* 에서 a*와 b*에 정비례하므로 색상 분석법으로 CIE L*a*b*를 선택하였다.

2. 실 험

2.1. 재료

Resazurin sodium salt, hydroxylamine (50% in water, HA), gold nanoparticle (5 nm diameter, stabilized suspension in citrate buffer, GNP)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Resorufin sodium salt은 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였다.

2.2. 디지털 이미지 획득과 색상 분석

색상 분석을 위해서 Nikon D5600과 5 W 백색 LED, 석영 셀을 사 용하였다. 5 W 백색 color LED를 20 cm 앞에 두어 빛의 밝기를 동일 하게 유지시켜 주었다. 카메라는 ISO 1/10, F 5.6, 조리개 최대 개방을 5로 세팅하였다. Wien의 변위 법칙에 의해 온도와 파장은 반비례이므 로 LED에서 방출되는 온도를 유지하기 위해 10 min 이상 충분한 시 간을 둔다. 빛의 파장 또는 주파수가 디지털 이미지에 줄 수 있는 영 향을 차단하기 위함이다[20]. 또한 카메라 기기의 한계점이라고 할 수 있는 플리커(flicker) 현상은 일반적으로 주 전압 공급의 변동 즉, 교류 전기에 의해 발생하는 화면 출력의 변조이다[21]. 플리커 현상을 최소 한 감소시키기 위해서 셔터스피드를 1/60보다 느리게 해야 하며 카메 라 외의 형광등과 같은 외부 조명 및 빛 또한 50~60 Hz를 가지기 때 문에 50, 및 60 Hz를 모두 상쇄할 수 있는 셔터스피드 1/10 값으로 결정하였다. 자외선가시광선분광법과 동일한 조건에서 실험하기 위해 석영 셀을 사용하였다. 획득한 디지털 이미지를 소프트웨어(GIMP)를 통하여 CIE L*a*b* 값을 추출하여 색상 분석을 하였다.

2.3. 색상 분석과 자외선가시광선분광법 분석 비교

RZ와 RF를 9 mM HA를 용매로 하여 1, 2, 4, 7, 및 10 μM 농도로 준비하고 자외선가시광선분광법을 통해 농도에 따른 흡광도를 측정 하였다. 파장은 200~800 nm에서 측정하고 baseline은 용매로 사용한 HA solution 9 mM를 사용한다. 색상 분석은 위와 동일한 시약을 사용 하고 디지털 이미지로부터 CIE L*a*b* 값을 추출하였다.

2.4. RZ의 환원 반응

RZ 8 μM 2 mL, HA 20 mM 1.8 mL, 5 nm GNP 0.321 mM 0.2 mL를 혼합하여 22 °C에서 환원 반응을 일으켜주었다. 자외선가시광 선분광법을 이용하여 5 min마다 흡수파장을 얻고 카메라를 이용해 30 s마다 디지털 이미지를 얻었다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 자외선가시광선분광법을 이용한 RZ와 RF 농도 측정

Figure 1(a)와 1(b)는 각각 10 μM 이하의 농도에서 RZ 및 RF를 자 외선가시광선분광법을 분석한 것이다. RZ, RF는 각각 약 601, 571 nm 에서 최대 흡광도가 나타난다. 농도에 따라 peak의 크기가 줄어들며 RZ와 RF의 최대 흡광도와 농도와의 관계를 각각 Figure 1(c)와 1(d)에 서 확인할 수 있다. RZ, RF 모두 1, 2, 4, 7, 및 10 μM에서 흡광도가 선형으로 변화하는 것을 확인하였다. Beer의 법칙을 통해 시료의 농 도와 흡광도 사이 관계식을 구할 수 있는데 결과적으로 RZ와 RF의 몰흡광도 계수는 각각 0.0446, 및 0.066 cm^-1μM^-1이다.

3.2. 색상 분석을 이용한 RZ와 RF 농도 측정

자외선가시광선분광법과 마찬가지로 1, 2, 4, 7, 10 μM의 RZ과 RF 를 준비하여 촬영을 통해 얻은 이미지는 각각 Figure 2(a)와 2(b)와 같 다. RZ는 푸른 계열, RF는 붉은 계열로 관찰되고 농도가 낮아짐에 따 라 색이 옅어지는 것을 확인할 수 있다. Figure 3(a)와 3(b)는 각각 RZ 와 RF의 농도에 따른 디지털 이미지를 GIMP소프트웨어를 통해 추출 한 CIE L*a*b* 색상 좌표 값이다. 이때 바탕을 제거하고 오직 색깔의 변화만 보기 위해 용매인 HA 9 mM의 색상 좌표 값을 추세선의 절편 으로 사용하였다. Figure 3에서 농도와 색상 좌표가 선형적인 관계를 보이기 때문에 식1은 RZ와 RF의 농도와 Figure 3의 색상 분석으로부 터 얻은 L*, a*, b* 값을 선형적으로 표현한 것이다. 각각의 관계식의 계수를 구하기 위해서 최소자승법을 사용했으며 L_RZ, a_RZ, b_RZ, L_RF, a_RF, b_RF, L₀, a₀, b₀는 각각 -1.81, -0.0135, -2.80, -1.17, 4.61, -2.45, 86.9, -1.60, -11.4 이다.

색상 분석을 통해 농도를 구하기 위해서는 색상 좌표에 따른 농도 의 변화식이 필요하므로 행렬 계산을 위해 식 1을 식 2와 같이 행렬 형태로 변환되며 RZ 및 RF의 농도에 따른 색상 좌표의 변화 관계식 을 알 수 있다.

최소자승법을 통해 L*, a*, b*값에 대한 농도의 관계는 식 3과 같이 표현된다.

이 때, x₁, x₂, x₃, x₄, x₅, x₆은 각각 -0.1222, -0.1927, -0.3041, -0.0414, 0.0468, 0.00152이다.

3.3. GNP를 이용한 RZ의 환원 반응

시간에 따른 RZ의 농도를 선형화 된 0, 1, 2, 3차 반응속도식에 대 입하여 반응속도상수 및 차수를 구할 수 있다. RZ의 환원반응 메커니 즘을 이해하기 위해서 몇 가지 가정이 필요하다. 첫 번째로 RZ를 RF 로의 환원 반응 실험은 유입과 유출이 없는 수용액 상에서 진행되므 로 정적 회분식 반응이다. 두 번째로 RZ에서 RF로의 환원 반응은 역 반응이 거의 없으며 전환율이 100%라고 가정한다. 세 번째로 환원제 로 사용하는 HA는 과량의 농도로 사용하고 촉매인 GNP는 생성되거 나 소멸되지 않고 일정하여 환원 반응은 RZ의 농도에만 의존한다. 이 러한 가정으로 RZ의 환원반응은 식 4와 같다[2].

여기서 C_R은 RZ의 농도, k_obs는 관측반응속도상수, n은 반응속도차수 이다[2]. 식을 바탕으로 적분법을 통해서 시간에 따른 농도 결과를 선형 화하여 반응의 차수를 구하였다. 반응 차수에 대해 0~3차까지 적용하였 고 농도에 따른 선형화 된 식은 각각 식 1-4로 표현될 수 있다[2].

3.3.1. 자외선가시광선분광법을 이용하여 RZ의 환원 반응 분석

Figure 4(a)는 RZ 환원 반응을 자외선가시광선분광법을 이용해 측 정한 그래프이다. 601 nm에서 최대 흡광도를 보이는 RZ이 시간이 경 과함에 따라 감소하여 약 3 h 경과 후 사라진다. 571 nm에서 최대 흡 광도를 가지는 RF는 시간이 경과함에 따라 농도가 증가하는 것을 알 수 있다. 이 때 RZ의 최대 흡광도는 RF의 흡수 파장과 겹쳐 있지 않 지만 RF의 최대 흡광도는 RZ의 흡수 파장과 겹치는 것을 볼 수 있다. Figure 4(b)는 시간에 따른 601 및 571 nm에서 최대값의 변화를 나타 낸 것이고 RF는 RZ의 흡수파장과 겹치기 때문에 시간이 0 min일 때 0이 아닌 값을 갖는다. Figure 4(c)는 흡광도를 농도로 바꾼 것이다. 이 때 RZ의 농도는 Beer의 법칙에 따라 Abs = 0.0446 × [RZ]를 사용 하여 RZ의 농도를 구할 수 있지만 RF의 농도는 직접적으로 구할 수 없고 RZ 초기 농도는 RZ과 RF 농도의 합과 같음으로 RF의 농도는 물질 수지식을 사용하여 계산할 수 있다.

반응속도식은 시간에 따른 농도 변화를 나타냄으로 농도를 통해 반 응속도 상수와 반응속도 차수를 구할 수 있다. Figure 5(a)-(d)는 각각 식 1-4에 주어진 반응속도식에 맞춘 결과이며 가장 선형으로 나타난 것은 Figure 5(c)이므로 RZ의 환원 반응은 2차 반응속도를 가진다는 것을 알 수 있고 반응속도상수는 0.029 μM^-1 min^-1이다.

3.3.2. 색상 분석을 이용하여 RZ의 환원 반응 분석

Figure 6은 시간에 따라 변화하는 RZ 환원 반응의 색상 이미지이다. RZ에서 RF로 환원이 될수록 파란 계열에서 붉은 계열로 변하게 되며 약 3 h 이후에는 색의 변화가 없다. Figure 7은 식 3에 CIE L*a*b* 색상 좌표를 대입해서 얻은 시간에 따른 RZ와 RF의 농도이다. 자외 선가시광선분광법을 이용한 결과와 다르게 색상 분석은 물질 수지식 을 사용하지 않고도 RZ와 RF의 농도를 구할 수 있다. 색상 분석을 통 해 식 1-4를 이용하여 선형화 된 식을 Figure 8과 같이 다양한 차수에 대해서 구했으며 가장 선형적인 반응식[Figure 8(c)]을 통해 자외선가 시광선분광법을 이용한 결과와 같이 RZ의 환원 반응은 2차 반응임을 확인하였다. 색상 분석으로 구한 반응속도상수는 0.030 μM^-1 min^-1 이 며 이는 자외선가시광선분광법으로부터 구한 반응 속도와 매우 유사 한 값임을 알 수 있다.

4. 결 론

CIE L*a*b*를 사용한 색상 분석을 통해 RZ과 RF의 농도를 측정하 고 GNP를 이용한 RZ의 환원반응 속도식과 반응속도상수를 구하였으 며 자외선가시광선분광법을 이용한 방법과 비교하였다. RZ와 RF은 각각 자외선가시광선분광법을 이용하였을 때 최대 흡광도와 농도는 선형관계를 가지고 Beer의 법칙을 만족한다. CIE L*a*b*로 색상 분석 을 이용하였을 때 RZ와 RF의 농도가 색상 좌표와 선형관계임을 확인 할 수 있고 최소자승법을 사용하여 색상 좌표의 값으로부터 RZ와 RF 의 농도를 계산하는 방법을 제시하였다. RZ의 환원 반응에서 자외선 가시광선분광법을 활용한 방법에서는 RZ와 RF의 흡수 파장이 겹치 는 문제로 RZ의 농도만 측정이 가능하고 RF의 농도는 물질 수지식으 로부터 추정할 수 있지만 CIE L*a*b* 색상 분석을 이용하였을 때는 RZ와 RF의 농도를 각각 측정할 수 있는 장점이 있다. 두 방법을 통해 RZ의 환원 반응은 2차 반응이며 반응 속도상수가 0.029 μM^-1 min^-1, 0.030 μM^-1 min^-1으로 유사하게 측정된다. 따라서 CIE L*a*b* 색상 분 석을 이용한 농도 분석 및 반응속도 분석은 자외선가시광선분광법과 동일한 결과를 얻을 수 있는 유효성을 확인할 수 있으며 RZ와 RF의 농도를 독립적으로 구할 수 있는 획기적인 농도 분석 및 촉매반응속 도 분석법을 제시하였다.