Journal Search Engine

ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)

Applied Chemistry for Engineering Vol.33 No.3 pp.235-241
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2022.1027

Utilization of qPCR Technology in Water Treatment

Won Jae Kim, Yunjung Hwang, Minhye Lee, Minsub Chung†

Department of Chemical Engineering, Hongik University, Seoul 04066, Republic of Korea

^† Corresponding Author: Hongik University Department of Chemical Engineering, Seoul 04066, Republic of Korea Tel: +82-2-320-1677 e-mail: minsubc@hongik.ac.kr

Received May 6, 2022 ; Review May 28, 2022 ; Accepted May 30, 2022

Abstract

According to the World Water Development Report 2015 released by the United Nations, drinking water is expected to decrease by 40% by 2030. This does not mean that the amount of water decreases, but rather that the water source is contaminated due to environmental pollution. Because microbes are deeply related to water quality, the analysis of microbe is very important for water quality management. While the most common method currently used for microbial analysis is microscopic examination of the shape and feature after cell culture, as the gene analysis technology advances, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) can be applied to the microscopic microbiological analysis, and the application method has been studied. Among them, a reverse transcription (RT) step enables the analysis of RNA by RT-PCR. Integrated cell culture (ICC)-qPCR shortens the test time by using it with microbial culture analysis, and viability qPCR can reduce the false positive errors of samples collected from natural water source. Multiplex qPCR for improved throughput, and microfluidic qPCR for analysis with limited amount of sample has been developed In this paper, we introduce the case, principle and development direction of the qPCR method applied to the analysis of microorganisms.

Key Words : Water treatment , Microorganism , Bacteria , Viruses , qPCR

수질분석에 사용되는 qPCR기술

김 원재, 황 윤정, 이 민혜, 정 민섭†

홍익대학교 화학공학과

초록

유엔이 발표한 세계 물개발 보고서는 2030년까지 식수가 현재보다 40% 감소할 것으로 전망하고 있다. 이는 물의 양이 감소하는 것이 아니라, 환경오염으로 인해 상수원이 오염되는 것을 말한다. 미생물이 수질에 깊은 연관이 있기 때문에 미생물의 분석은 수질관리에 매우 중요하다. 현재 미생물 분석에 사용되는 방법은 배양 후 현미경을 통한 모양과 형 태를 분석하는 것이 가장 일반적이나, 유전자분석 기술이 발달함에 따라 현미경을 통한 미생물 분석 방식에 qPCR (quantitative polymerase chain reaction) 적용이 가능해졌고 활용방법 등이 연구되었다. 그 중에는 역전사 단계를 추가하 여 RNA 분석에 용이성을 부여한 RT-qPCR법과 미생물 배양분석에 접목시켜 검사시간을 단축시키는 ICC-qPCR, 자연 에서 채취한 샘플의 위양성율을 감소시키는 데 용이한 viability qPCR, 다중분석에 용이한 multiplex qPCR, 소량의 샘플 만으로 분석이 가능한 microfluidic qPCR법 등이 있다. 본 논문에서는 이처럼 qPCR 방법이 미생물 분석에 적용되는 사례와 방식의 원리, 그리고 발전 방향에 대해 소개하고자 한다.

키워드 :

This article has been cited by 0 article in crossref

Cited-By

Funding:

1. 서 론

UN은 2015년에서 2030년까지 지속가능발전목표(UN Sustainable Development Goals: SDGs) 17가지를 지정했다[1]. 그중 환경과 관련 된 것으로 물의 위생, 지속가능한 청정에너지, 기후변화대응, 해양생 태계, 육상생태계 등의 항목이 있으며 이들 중 인류에 가장 직접적인 위험이 될 수 있는 문제는 물의 위생 문제이다. 깨끗한 물의 공급은 기후, 환경오염문제와 밀접히 연관되어 있으며 식수뿐만 아니라 물을 사용하는 농작물 등에 영향을 미친다[2].

일례로 낙동강 물로 생산한 쌀, 배추, 무에서 마이크로시스틴 (microcystin)이 검출된 사례가 있다. 세계보건기구(WHO)에서 마이크로 시스틴의 간손상 안전기준을 0.04 ug/kg-day 이하로 규제하고 있을 만큼 대표적인 수인성 유해인자로 간에 독성을 유발하여 건강에 위험을 초래 하는 물질이다. 이러한 독성물질인 마이크로시스틴은 낙동강과 한강에 서 종종 녹조의 원인이 되는 남세균(cyanobacteria)들이 만들어낸다[3]. 대표적으로 Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon 등이 있는 데 이는 환경부에서 정한 녹조 경보를 발생시키는 “유해 남조균”에 해당된다. 이 외에도 남세균은 신경 시냅스와 신경 엑손에 손상을 일으 키는 anatoxin, saxitoxins 등을 만들어 내는 것으로 보고되고 있다[4].

유해 남세균 번창의 주요 원인으로는 부영양화와 수온 상승이 있다. 부영양화란 남세균의 먹이가 되는 질소와 인이 강에 유입되는 것을 의미한다. 남세균의 번창을 억제하기 위해서는 질소와 인을 제거하여 야 하는데 이는 수처리를 통해 제거된다. 수처리는 활성슬러지법의 2 차처리와 고도처리로 나눌 수 있다. 고도처리는 미생물의 질화작용 및 탈질화 작용을 포함한다. 이에 관여하는 미생물에는 암모니아산화 세균(ammonia-oxidizing bacteria, AOB), 암모니아산화고균(ammoniaoxidizing archaea, AOA), 아질산산화세균(nitrite-oxidizing bacteria, NOB), 탈질화 세균, 아나목스 미생물 등이 있다[5]. 인 제거는 세포 내 인 함량이 20~30%에 달하는 인 축적 미생물(phosphate accumulating organisms, PAOs) 군집이 물 내의 인을 분해하는 과정을 통해 이 루어진다. 물속에는 유해 미생물과 유익한 미생물이 공존하고 있기 때문에 종의 분석도 중요하지만 우세종을 구분하는 것 또한 매우 중 요하다.

박테리아 등 미세균을 분석하는 가장 기본적인 방법으로 현미경 등 의 광학분석을 통한 계수가 있다. 이 방법은 형태로 분석할 수 있는 경우에 가장 널리 사용되지만 세포의 크기가 작은 종류와 군체를 이 루는 남조류의 경우에는 분석이 용이하지 않다. 현미경 분석의 특성 상 많은 양의 표본을 측정할 수 없으므로 오차를 가질 수 있음이 지적 되어 왔다[6]. 최근에는 복잡한 환경 샘플에서 유전자를 정량하기 위 한 분자 기술의 발달로 보다 다양한 수질 분석법들이 개발되었다. 그 대표적인 예로 형광 프로브를 핵산에 결합시켜 그 밝기를 측정하는 FISH (fluorescence in situ hybridization) 기법, [7] 변성제의 농도가 다 른 특수한 겔 내에서 이루어지는 DNA의 이동속도 차이를 이용한 DGGE (denaturing gradient gel elctrophoresis), 검체 내의 핵산을 검출 하고 이를 정량화하여 그 수를 알아보는 qPCR (quantitative polymerase chain reaction) 등이 있다. 이 중 qPCR 방법은 미세균의 정성/정량 분석에만 국한되지 않고, 16S rDNA 또는 기능성 유전자를 검출하거 나[8,9], rotavirus, adenovirus 등의 수인성 질병의 분석에도 용이하다 [10]. 본 총설에서는 수질 분석에 중요한 미세균총을 검출하는 PCR 기반 기법들을 중심으로 고찰하고, 이들의 최근 발전 방향에 대해 살 펴보고자 한다.

2. 정량적 PCR 기법 원리와 환경미생물 분석 활용

qPCR은 quantitative PCR로 정량 분석과 정성분석이 동시에 가능한 PCR 방법을 뜻한다. 증폭된 DNA 산물을 전기영동을 통해 확인하는 기존 방식과 달리, 형광 reporter를 사용하여 광학 분석 방식으로 증폭 량을 모니터링할 수 있고, 증폭과 검출이 동시에 이루어져 검사 속도 가 빠르고 오염 가능성이 낮은 장점이 있다[10]. 특히 미량의 미생물 을 검출해야 하는 수질 분석의 특성상, 극미량의 유전자 샘플을 증폭 시켜 높은 민감도로 검출하고 정량할 수 있다는 것이 가장 큰 장점이 다. 형광 검출 방식은 두 종류로 나눌 수 있는데, 이중가닥 DNA에 삽 입되면 발광하는 intercalating dye를 사용하는 방식과, 특정 서열의 DNA에 형광 dye와 상쇄물질(quencher)을 결합시킨 probe를 사용하는 방법이다[11]. 두 방법 모두 증폭산물의 수와 비례하게 형광을 발생시 키는데 이러한 형광반응을 측정한 후 일련의 계산 과정을 거치면 최 종적으로 증폭 산물의 DNA 양을 유추해낼 수 있다.

2.1. 이중가닥 DNA 결합 형광 표지자 기반 qPCR

SYBR Green, EvaGreen 등의 이중가닥 DNA intercalating dye를 사 용하는 방식에서는 형광표지가 DNA 이중가닥에 삽입될 때 크게 증 가하는 형광표지의 신호를 측정하는 방식으로, DNA의 증폭양에 비례 해 증가하는 형광신호를 측정한다(Figure 1A). 이때 형광이 임계값 (threshold)을 넘어 급격하게 증가하는 주기(Cycle)를 Ct (threshold cycle) 라고 한다(Figure 1C).

Figure 1D는 복제 수를 알고 있는 샘플을 qPCR하여 결과 값을 초 기 DNA 농도에 따라 도시한 것이다. 초기농도가 높을수록 threshold 에 도달하는 Cycle이 빨라지게 된다. DNA 농도를 통제하여 그래프로 나타내면 Figure 1D가 되며 각 점을 이어 검량선을 만든다. 미지시료 의 Ct값을 측정하여 값을 검량선에 대입해 초기 DNA 양을 산출할 수 있다.

이 방식은 프라이머가 비특이적으로 증폭하는 경우에도 형광신호 가 증가하기 때문에 위양성이 생길 수 있다. 이 때문에 추가적으로 melting curve를 분석하여 증폭이 특이적으로 되었는지 검증이 가능하다. Melting curve 분석은 특이적으로 증폭된 DNA의 Tm (melting temperature) 에 해당하는 온도로 가열하였을 때 denature되며 감소하는 형광 신호를 측정하는 방법으로 위양성을 감별하는 분석방법이다[12].

2.2. 프로브 결합형 형광 표지자 기반 qPCR

Taqman probe 방식으로 대표되는 probe-based detection system은 비특이적 증폭에 의한 위양성이 적은 장점이 있으며, 최근 COVID-19 진단에 널리 사용되어 그 유용성을 입증하였다. 5' 말단에 Applied Biosystems FAM 또는 VIC 등의 형광표지가 붙어 있고 3' 말단에 MGB (minor groove binder) 및 무형광 소광제(NFQ) 등의 quencher가 합성되어 있는 프로브를 primer서열 사이에 특이적으로 결합하게 디 자인하여 사용한다(Figure 1B). Taq 중합효소의 5'-exonuclease 활성에 의해 신장과정(elongation)에서 형광표지가 probe DNA와 해리되고 quencher와 분리되며 형광신호가 증가한다. 이 신호를 cycle별로 도시 하면 Figure 1C와 같다. 정량분석은 DNA binding dye를 사용하는 경 우와 마찬가지로 Ct검량선을 대조하여 판별한다[10]. 이 방식은 비가 역적 반응으로 melting curve를 적용하지 못하지만, 1쌍의 프라이머와 probe가 모두 표적위치에 부착되어야 형광이 감지되므로 위양성 비율 이 낮은 장점을 가진다.

Kaetzke 등에 의해 이루어진 연구는 qPCR 기술이 어떻게 수처리 산업에 도움을 줄 수 있는지 알려주는 구체적인 예시이다. 그들은 벌 킹 현상(슬러지가 침전되지 않고 수면 위로 떠오르는 현상)의 주요 원 인균인 Microthrix parvicella에 대해 알아보기 위해 독일 폐수처리장 에서 수집된 32개의 활성 슬러지 샘플들을 qPCR로 분석하였다. 그리 고 실험 결과, 전체 슬러지 균 중 M. parvicella 16S rRNA 유전자 복 제의 백분율이 3% 이상인 샘플들이 평균적으로 벌킹 현상을 일으킨 다는 사실을 알아냈다[13]. 이는 벌킹 현상은 오직 슬러지 내에 존재 하는 균의 수에만 영향을 받는 것이 아니라 그 균의 종류에 의해서도 좌우된다는 사실을 의미한다. 그러므로 하수처리장은 슬러지 내에 존 재하는 우점종이 무엇인지 알아보고 이에 근거하여 생물학적 처리 공 정을 운영할 필요가 있다.

2.3. RNA 검출의 위한 RT-qPCR (Reverse Transcription-qPCR)

RT-qPCR은 RNA를 역전사(reverse transcription)시키는 과정이 DNA증폭 이전에 수행된다. RNA를 추출하고 이를 역전사 효소를 사 용하여 cDNA를 생산한 후 DNA 증폭시키는 과정을 거치는데 역전사 방식에 따라 원스텝 방식과 투스텝 방식으로 나뉜다. 원스텝 방식의 경우 투스텝 방식에 비해 공정단순성의 확보가 용이하다(Figure 2)[14]. 이 때문에 COVID-19 진단에 원스텝 역전사 방식을 사용하여 표준 검사 방법으로 자리잡았다. 투스텝 방식은 역전사 단계와 증폭 단계에서 각각 최적화가 가능하여 유전자 발현 분석 등에 활용된다. 활용에 따라 바이러스 등의 RNA 표적 primer를 사용하는 방법과 random primer를 사용하는 방법으로 나뉜다. 역전사에 표적 프라이머를 사용하는 방법은 nested-PCR과 유사한 방식으로 높은 민감도를 가질 수 있다. Random primer로 PCR하는 방법은 two step RT-qPCR방식을 활용한다. PCR후 band 분석을 통하여 샘플의 다양성을 분석할 수 있 지만 reporter dye의 종류가 다양하지 않기 때문에 검출종에 한계가 있 다. RNA는 세포 외부에서 안정성이 낮아 분해되기 쉽기 때문에 죽은 세포에 의한 위양성율이 낮다는 장점을 가지고 있다.

3. 오염수 내 미생물 검출 정확도 향상을 위한 qPCR 기법

3.1. 세포배양을 통해 정확도를 향상시킨 ICC-qPCR (Integrated Cell Culture-qPCR)

ICC-qPCR은 세포배양법에 qPCR이 결합된 기술이다. 기존 세포 배 양법을 이용한 병원성 미생물 검출은 정상적인 세포에 채취한 샘플을 섞어 세포병변(병원성 미생물의 활동으로 인한 세포 변형, 파괴 등의 변화)이 발생하는지 확인하는 것으로, 감염성이 있는 위해 바이러스 를 선택적으로 검출할 수 있는 방식이다. 반면, 세포의 병변이 발생할 때까지 배양시간이 필요하며 감염성이 없는 바이러스의 경우에는 세 포병변이 발생하지 않기에 오진의 가능성이 있다[14]. 이를 PCR로 보 완한 ICC-qPCR은 세포에 바이러스가 포함되어 있을 것으로 추정되 는 샘플을 도포하고 24시간가량의 짧은 시간동안 배양한 후 유전자를 추출하여 qPCR 검사를 수행한다(Figure 3). 이 방식은 세포배양 방식 에 비하여 시간이 단축되며 감염성이 없는 바이러스 또한 분별할 수 있는 장점을 가진다. 하천 또는 폐수에서 채취한 샘플에 포함되어 있 을 수 있는 PCR inhibitor의 영향을 최소화시킬 수 있기 때문에 위음 성 비율을 효과적으로 줄일 수 있다. Li 등은 ICC-qPCR을 활용하여 폐수 또는 하천 샘플 내에 존재하는 rotavirus를 검출하였다[15]. RT-qPCR 방법으로 폐수샘플을 증폭한 경우에서는 DNA 증폭이 이루 어지지 않았다. 이는 폐수에 존재하는 다양한 PCR Inhibitor의 영향으 로 추측할 수 있다. RT-qPCR 방법으로 상대적으로 불순물이 적은 하 천의 샘플을 분석한 경우에는 낮은 바이러스 농도로 인하여 검출이 되지 않았다. 두 가지 경우에서 ICC-qPCR 방법은 효과적으로 바이러 스를 검출할 수 있었다.

Ogorzaly 등은 불순물이 많아 qPCR 기법을 사용하기 어려운 활성 슬러지에서 ICC-qPCR로 adenovirus를 검출[13]하는 데 성공하였으며, 활성 슬러지와 강물에서 검출 결과를 비교하였다. 이 연구는 특히 가 장 널리 퍼진 공중 보건 관련 장내 아데노바이러스에 대한 광범위한 유형의 수질 시료에서 ICC-qPCR 기법의 활용성을 확인하였다.

3.2. 위양성 억제를 위한 Viability qPCR

Viability qPCR은 DNA에는 강하게 결합하지만 세포막은 통과하지 못하는 viability 염료를 사용하여 죽은 세포에 의한 위양성 결과를 억 제하는 qPCR이다. 대표적인 viability 염료로는 EMA(Ethidium monoazide), PMA(propidium monoazide), PMAxx™가 있으며 각 염료를 사 용한 qPCR을 EMA-qPCR, PMA-qPCR, PMAxx-qPCR이라 부르기도 한다(Figure 4). DNA 샘플에 viability 염료를 가하면 이 염료는 세포 막이 손상된 죽은 세포의 DNA에만 접근이 가능하다. 이어서 샘플을 자외선에 노출시키면 염료가 반응성을 갖게 되고 DNA와 공유결합을 이룬다. 염료가 결합된 DNA는 PCR 과정에서 증폭이 이루어지지 않 는다. 이에 따라 viability qPCR은 세포 배양을 하지 않더라도 죽은 세 포의 DNA가 증폭되는 위양성을 감소시킬 수 있다. Gedalanga 등은 이러한 viability qPCR이 죽은 세포에 대해 어느 정도의 반응 감소를 보이는지 확인하고자, 낮은 탁도의 개울물과 높은 탁도의 활성 슬러 지 샘플을 같은 농도의 EMA로 처리한 뒤 qPCR한 결과와, 해당 샘플 을 가열하여 대부분의 미생물을 사멸시킨 후 다시 EMA-qPCR한 경우 그 복제 수를 비교하였다[16]. 그 결과, 가열된 개울물 및 슬러지 샘플 모두에서 상당한 반응 감소를 확인할 수 있었다. 다만, 개울물이 대부 분의 양성 반응을 억제하여 검출 한계 미만의 결과를 보인 반면 슬러 지는 여전히 유의미한 양성 반응을 나타냈다. 이는 샘플의 높은 탁도가 viability 염료의 광활성화를 저해하여 결국 EMA-qPCR의 효과를 전 반적으로 떨어뜨린 것이라 추정된다[17]. PMA와 PMAxx는 EMA의 작용기를 변형시킨 염료이다. 이 두 염료는 EMA보다 더 높은 민감도 와 죽은 세포에 대한 향상된 선택도를 가질 수 있도록 개발되었다[17].

Viability qPCR은 기존의 세포 배양법이나 ICC-qPCR과 비교하여 비교적 간단한 과정과 짧은 시간으로 죽은 세포를 구분해낼 수 있게 하였다. 하지만 자연환경에 존재하는 PCR inhibitor에 의해 위음성이 발생할수 있으며 세포의 종류에 따라 염료의 비특이적 세포막 투과가 발생할 수 있어 위음성의 위험성은 존재한다[18]. 이 방법이 충분한 효과를 보이려면 탁도가 10 NTU (nephelometry turbidity unit)보다 낮 아야 한다[16]. 그리고 미생물은 때때로 세포막이 손상되지는 않았지 만 비활성화 될 수 있고[18], 반대로 세포막이 손상되었지만 여전히 미생물이 병원성을 가지고 있을 수도 있다[19]. 이는 세포막의 손상 여부가 언제나 세포의 비활성화, 더 나아가 병원성의 여부와 일치하 지 않는다는 것을 의미한다. 마지막으로 미생물들은 종류에 따라 막 투과성이 다르고 이는 viability qPCR 결과에 영향을 끼칠 수 있다 [20]. 그러므로 여러 미생물을 대상으로 viability qPCR을 진행하는 경 우 이러한 차이를 고려해야 한다.

4. 대용량 수질 샘플 처리용 qPCR 기법

4.1. Multiplex qPCR

Multiplex qPCR은 한 번의 반응으로 두 종류 이상의 검체에 대해 qPCR을 수행하는 방법이다. 즉, 다른 염기 서열을 가진 유전자 두 종 류 이상을 하나의 웰(well)에 넣어 한 번에 증폭시키는 것이다. 이 방 법은 qPCR에 드는 시간을 최소 두 배 이상 절약하고 전반적인 시험 비용과 자원을 획기적으로 줄일 수 있다는 장점이 있으나, 증폭되는 두 검체의 반응속도가 크게 다른 경우 dNTP, DNA 중합 효소와 같은 공통시약을 반응속도가 빠른 검체가 대부분 소비하여 반응속도가 느 린 대상이 제대로 증폭이 되지 않을 수 있다. 때문에 multiplex qPCR 은 증폭속도가 비슷한 대상들끼리 수행되어야 한다. 이에 따라 multiplex qPCR로 동시에 정량화 할 유전자의 종류가 많을수록 고려사항 이 많고 probe reporter 종류의 한계로 검사수의 제한이 존재한다. Ahmed 등은 multiplex qPCR을 이용해 수처리 전 하수와 빗물 샘플을 분석하였다[21]. 정량화의 대상이 된 유전자는 하수의 오염 판단에 널 리 사용되는 세균인 Bacteroides의 유전자 마커 HF183과 역시 하수에 주로 분포하며 박테리오파지 중 하나에 해당되는 CrAssphage 유전자 마커 CPQ_056였다. 연구진은 같은 샘플에 대해 Multiplex qPCR은 물 론 기존의 단일 타겟 qPCR (Simplex qPCR)을 진행하였으며 두 정량 데이터를 비교하였다. 그 결과 multiplex qPCR이 기존 단일 qPCR과 동등한 정량 성능을 보인다는 사실을 확인할 수 있었다. 이는 multiplex qPCR은 제대로 된 실험 설계가 보장될 수 있다면 단일 qPCR만 큼의 충분히 신뢰성 있는 결과를 보인다는 사실을 의미한다.

4.2. Microfluidic qPCR

Microfluidic qPCR은 아주 적은 양의 유체가 흐르는 미세 채널을 가진 미세유체장치를 이용한 qPCR을 뜻한다. 난양공대의 Micromachines lab에서는 다수의 수인성 병원균들을 동시에 검출할 수 있는 microfluid device를 고안하였다(Figure 5). 네 가지 병균을 타겟으로 하는 건조된 프라이머 쌍을 각 microreactor에 미리 도포한 후(Figure 5A), 시료 용액을 주입하여 흡수패드의 모세관 현상에 의해 각 microreactor에 주입되도록 한다(Figure 5C). 이후 PCR 반응을 통해 형광 신 호를 모니터링 한다[22]. 이 연구에서는 복잡한 펌프나 밸브 등의 장 비 없이, 소량의 유체를 모세관 현상을 통해 채널을 따라 다수의 구획 에 있는 microreactor에 해당 유체가 흘러 들어가도록 하여 검출 과정 을 단순 자동화 시키는 성과를 거두었다. 이를 통해 아주 적은 양의 유체로 여러 유전자를 대상으로 하는 단일 qPCR을 동시에 수행할 수 있다. 이 방법은 2 ul 수준의 적은 양의 샘플만을 필요로 하며 multiplex qPCR에서 고려해야 했던 서로 다른 형광 염료의 사용이나 공통 시약 부족의 문제점을 해결할 수 있다.

Ishii 등은 상용화된 Dynamic Array™ 칩(Fluidigm)을 이용하여 microfluidic qPCR을 수행해, 수인성 바이러스인 Adenovirus, Aichi virus, Astrovirus 등 총 11가지 종류의 바이러스를 동시에 정량하였다. 그리고 그 결과, 모든 유전자에서 검출이 이루어졌으며 murine norovirus를 기준으로 microfluidic qPCR의 정량 결과는 단일 qPCR에서 얻은 결과와 유사하였다[23]. 이는 microfluidic qPCR의 정확도가 단 일 qPCR에 비해 떨어지지 않는다는 사실을 시사한다. 그러나 microfluidic qPCR은 검체의 반응 부피가 매우 작고 온도조건 등을 다양화 하기 어려워 다른 qPCR 기술들보다 프라이머 선정이 까다롭다[24]는 단점이 있다.

5. 결 론

본 총설 논문에서는 정확성이 뛰어나고 최근 전국적으로 인프라가 확충된 qPCR 분자진단법을 활용한 수질 검사법의 종류에 대해 고찰 하고, 기존 한계를 개선하기 위한 발전 방향에 대해 소개하였다. COVID-19의 진단에 사용되면서 접근성이 크게 높아진 qPCR은 가장 신속하고 정확하다는 장점이 있지만, 표적 유전자에 정확한 분석이 필요하므로 프라이머 제작과 유전정보 분석에 소요되는 비용이 높다 는 단점이 있으며, 오염이 심한 수질 샘플의 경우 PCR 반응이 저해될 가능성이 있다. ICC-qPCR은 이러한 문제를 보완하여 시료의 오염도 와 상관없이 낮은 위양성율을 가지며, 감염성이 있는 바이러스를 검 출하는데 용이하여 병원성바이러스의 진단에 용이한 장점을 가진다. 반면 qPCR에 비교하여 신속성이 떨어지며 실험자의 숙련도가 필요한 단점이 있다. 살아있는 미생물만 선택적으로 검출할 수 있는 viability PCR의 경우에는 오증폭율이 적어 감염성 미생물을 검출할 필요성이 있는 진단방식에 유용하므로 상수원 등에 존재하는 미생물을 분석하 는데 사용된다. Microfluidics 기술을 활용한 PCR 방식은 매우 소량 시료에서도 검출이 가능하며 다수 시료의 동시 검출과 연속공정에서 활용될 수 있는 장점을 가져 향후 발전이 기대된다. 이러한 다양한 qPCR 방법은 수질측정 및 분석에서 각각의 분야에 적용되고 있으나 발전 속도가 빠르지 않다. 코로나의 진단을 위하여 발전된 기술들이 적절한 분야에 적용되기 위해서는 그 방식들의 장단점에 대한 이해가 필요하다.

Borchardt 등은 100편의 qPCR 및 Digital PCR을 활용한 환경 미생 물학 논문을 검토하였다. 이에 따르면 qPCR과 관련된 100편의 논문 중 약 1/4만이 Ct 및 표준 곡선 기울기와 같은 qPCR 정량화에 있어 필수적인 실험값을 보고하였다. 이에 이 연구에서는 Ct 및 표준 곡선 기울기의 의무적인 표기와 연구의 신뢰성을 높이기 위해 음성 및 양 성 대조군 실험을 실시할 것을 권장하였다. 그리고 추가적으로 The digital MIQE guidelines에 따라 연구 용어들을 단일화할 것을 제안하 였다[25]. 이렇듯 qPCR을 활용한 수처리 분야의 연구에 있어 그 과정 을 체계적으로 정립하고 용어를 통일해서 사용하는 것이 관련 논문이 나 자료의 전반적인 수준 향상에 기여할 앞으로의 과제일 것이다.

감 사

이 논문은 중소벤처기업부의 재원으로 산학연 Collabo R&D 사업 (S2911082), 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단(NRF-2021 R1F1A1046822)의 지원을 받아 수행되었으며, 연구비 지원에 감사드 립니다.

Figures

Figure 1.(A) qPCR with DNA intercalating dyes. The reporter dyes become fluorescent as inserted to double strand DNA selectively during extension step. (B) The principle of TaqMan probes. Fluorescence occurs as the reporter dye separates from the quencher dye in extension step. (C) The amplification plots from the extension phase fluorescent emission data. Ct values are calculated by determining the point at which the fluorescence exceeds a threshold limit. (D) Calibration curve showing Ct changes according to template DNA concentration.

Figure 2.Schematics of the RT-qPCR principle and process.

Figure 3.The method for confirming the cytopathic effect requires a culture period of 5 to 7 days, whereas the method for qPCR requires less than 24 hours of incubation time.

Figure 4.Schematics of the viability qPCR. The viability dye can enter the damaged cells through the cell membrane and be bound to DNA when irradiated with UV light.

Figure 5.Schematic of the microfluidic qPCR operation. (A) The PCR mixture loading step, (B) The crosssectional view of the PCR array chip with a localized thermal electric cooler (TEC) and heat-sink. (C) Sample loading and thermal cycling. (D) Photograph of the PDMS-glass chip comprising an array of nine microreactors[22].

Tables

References

World Water Assessment Programme, Water for a sustainable world, The United Nations World Water Development Report, 20-34, UNESCO, Paris, France (2015).
World Water Assessment Programme, Wastewater: the untapped resource, The United Nations World Water Development Report, 12-18, UNESCO, Paris, France (2017).
B. Jeon, J. Han, S.-K. Kim, J.-H. Ahn, H.-C. Oh, and H.-D. Park, An overview of problems cyanotoxins produced by cyanobacteria and the solutions thereby, J. Korean Soc. Environ. Eng., 37, 657- 667 (2015).
J. Kim, J. Lim, and C. Lee, Quantitative real-time PCR approaches for microbial community studies in wastewater treatment systems: applications and considerations, Biotechnol. Adv., 31, 1358-1373 (2013).
J. Nestorov, G. Matić, I. Elaković, and N. Tanić, Gene expression studies: How to obtain accurate and reliable data by quantitative real-time RT PCR, J. Med. Biochem., 32, 325-338 (2013).
H. Jung, B. Yim, S. Lim, B. Kim, B. Yoon, and O. Lee, Development of mcyB-specific ultra-rapid real-time PCR for quantitative detection of Microcystis aeruginosa, J. Korean Soc. Water Environ., 34, 46-56 (2018).
A. Moter and U. B. Göbel, Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms, J. Microbiol. Methods, 41, 85-112 (2000).
T. Narihiro and Y. Sekiguchi, Oligonucleotide primers, probes and molecular methods for the environmental monitoring of methanogenic archaea, Microbial Biotechnology, 4, 585-602 (2011).
Z. Zhou, J. Chen, H. Cao, P. Han, and J. D. Gu, Analysis of methane- producing and metabolizing archaeal and bacterial communities in sediments of the northern South China Sea and coastal Mai Po Nature Reserve revealed by PCR amplification of mcrA and pmoA genes, Frontiers in microbiology, 5, 789 (2015).
C. A. Heid, J. Stevens, K. J. Livak, and P. M. Williams, Real time quantitative PCR, Genome Res., 6, 986-994 (1996).
M. Tajadini, M. Panjehpour, and S. H. Javanmard, Comparison of SYBR Green and TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes, Adv. Biomed. Res., 3, 85 (2014).
Y. Cao, M. Yu, G. Dong, B. Chen, and B. Zhang, Digital PCR as an Emerging Tool for Monitoring of Microbial Biodegradation, Molecules, 25, 706 (2020).
V. Kapoor, T. Pitkänen, H. Ryu, M. Elk, D. Wendell, and J. W. Santo Domingo, Distribution of human-specific bacteroidales and fecal indicator bacteria in an urban watershed impacted by sewage pollution, determined using RNA-and DNA-based quantitative PCR assays, Appl. Environ. Microbiol., 81, 91-99 (2015).
L. Ogorzaly, H.-M. Cauchie, C. Penny, A. Perrin, C. Gantzer, and I. Bertrand, Two-day detection of infectious enteric and non-enteric adenoviruses by improved ICC-qPCR, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97, 4159-4166 (2013).
D. Li, A. Z. Gu, W. Yang, M. He, X. Hu, and H.-C. Shi, An integrated cell culture and reverse transcription quantitative PCR assay for detection of infectious rotaviruses in environmental waters, J. Microbiol. Methods, 82, 59-63 (2010).
P. B. Gedalanga and B. H. Olson, Development of a quantitative PCR method to differentiate between viable and nonviable bacteria in environmental water samples, Appl. Microbiol. Biotechnol., 82, 587-596 (2009).
Biotium, Viability PCR PMAxx and PMA Viablity PCR Dyes, accessed April 25, 2022 Retrieved from https://biotium.com/technology/pma-for-viability-pcr.
A. Nocker, K. E. Sossa, and A. K. Camper, Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR, J. Microbiol. Methods, 70, 252-260 (2007).
J. D. Oliver and R. Bockian, In vivo resuscitation, and virulence towards mice, of viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus, Appl. Environ. Microbiol., 61, 2620-2623 (1995).
L. Vondrakova, H. Turonova, V. Scholtz, J. Pazlarova, and K. Demnerova, Impact of various killing methods on EMA/PMA-qPCR efficacy, Food Control, 85, 23-28 (2018).
W. Ahmed, S. Payyappat, M. Cassidy, and C. Besley, A duplex PCR assay for the simultaneous quantification of Bacteroides HF183 and crAssphage CPQ_056 marker genes in untreated sewage and stormwater, Environ. Int., 126, 252-259 (2019).
N. Ramalingam, Z. Rui, H. B. Liu, C. C. Dai, R. Kaushik, B. Ratnaharika, and H. Q. Gong, Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens, Sensors Actuators B Chem., 145, 543-552 (2010).
S. Ishii, G. Kitamura, T. Segawa, A. Kobayashi, T. Miura, D. Sano, and S. Okabe, Microfluidic quantitative PCR for simultaneous quantification of multiple viruses in environmental water samples, Appl. Environ. Microbiol., 80, 7505-7511 (2014).
S. L. Crane, J. Van Dorst, G. C. Hose, C. K. King, and B. C. Ferrari, Microfluidic qPCR enables high throughput quantification of microbial functional genes but requires strict curation of primers, Front. Environ. Sci., 6, 145 (2018).
M. A. Borchardt, A. B. Boehm, M. Salit, S. K. Spencer, K. R. Wigginton, and R. T. Noble, The environmental microbiology minimum information (EMMI) guidelines: qPCR and dPCR quality and reporting for environmental microbiology, Environ. Sci. Technol., 55, 10210-10223 (2021).