1. 서 론

최근 나노입자기술을 이용한 응용 범위가 확대되어 다양한 목적을 가지고 많은 연구들이 수행되어 오고 있다. 나노입자 중에서 자성의 성질을 갖는 산화철 나노입자는 외부의 자기장에 반응하는 특성을 가 지고 있으며, 생체적합성이 뛰어나 약물전달시스템(drug delivery dystem, DDS)에 적용된 연구가 수행되었거나, 자기공명영상(magnetic resonance image, MRI) 기술과 접목되어 MRI 조영제와 같은 질병의 진단에 관한 연구분야의 물질로 연구되어져 왔다. 특히, 산화철 나노 입자 중에서 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SIONs)는 외부 전기장에 의해 표적 영역으로의 이동이 용이하여 다양한 생물의학 응용을 개발하는 데 널리 사용되고 있다 [1-10]. 생체적합성 고분자로 자성나노입자를 함유한 구형의 나노캡슐 제형을 제조하고, 그 제형의 표면에 표적형 항체가 수식된 에멀젼 상 의 주사제형(injection formulation)을 제조하여 MRI를 통해 질병에 대 한 진단동시 치료에 관한 연구들에 응용되었으나, 이는 약물을 전달 하는 방법 중에서 피하주사(hypodermic needles) 제제로 약물을 빠르 게 전달하여 효과를 즉시 얻을 수 있다는 장점도 있지만, 개인별 환자 에 따라서 극심한 주사제제에 대한 스트레스 정도의 부담을 유발할 수도 있는 단점을 가지고 있다[11-14].

이에 피부를 통한 경피약물전달시스템(transdermal drug delivery system, TDDS)의 경우, 정맥으로 주사하여 약물을 전달하는 주사제제 투여 방식에 비해 쉽고 편하며, 보다 안전하게 국소부위에 직접적으 로 작용하여 최근 DDS 대안 중의 하나로 연구되어 오고 있다. TDDS 로 약물을 전달하기 위해서는 피부의 각질층을 투과하여 유효성분을 전달해야 한다. 하지만, 피부의 각질층으로 인한 낮은 흡수력에 의해 적용에 제한을 받고 있어 이러한 단점을 보완하기 위해 마이크로니들 (microneedles, MNs) 제형을 이용하여 유효성분물질을 전달하려는 많 은 연구들이 수행되고 있다[15-21].

MNs는 기존 TDDS의 문제점인 각질층에 의한 유효성분물질전달의 한계를 보완하여 극복할 수 있는 전달 방식으로 피부 각질층 부위에 물리적으로 미세한 구멍을 뚫어 그 작은 통로를 이용하여 유효성분물 질을 효과적으로 전달하는 방식이다.

본 연구에서는 생분해성 고분자인 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 과 카르복시메틸셀룰로우즈(carboxy methyl cellulose, CMC)를 각각 의 MNs의 매트릭스(matrix)인 부형제로 사용하여 matrix 안에 SIONs 를 함유하는 초상자성 마이크로 니들(superparamagnetic microneedles, SMNs)인 HA-SMNs와 CMC-SMNs를 각각 제조하여 각 SMNs의 표 면 형상과 자성의 특성을 분석하였다. 또한, 고분자막(polymer membrane) 과 바이오막(bio membrane, porcine skin)을 통해 SMNs의 피부 투과도(permeability intensity)를 측정하여 기계적 특성을 확인하였다.

2. 실 험

2.1. 실험재료

본 연구를 위해 사용된 초상자성 산화철 나노입자(SIONs, 900041, 15 nm avg. part. size, N-succinimidyl ester functionalized)와 카르복시 메틸셀룰로우즈(CMC, 419273, sodium carboxymethyl cellulose, average MW ~90,000)와 trypan blue 0.4% solution는 Sigma-Aldrich사에 서 구입하여 사용하였으며, 히알루론산(HA, bio sodium hyaluronate, MMW, molecular weight 1.3~1.8 MDa)은 SK 바이오랜드에서 구입하 여 사용하였다. MNs의 원판(master)은 높이(height) 500 um과 width 250 um의 Aspect Ratio 2 (2:1) 비율로 설계하였고, 원판 원형 외경 ⌽15, 니들 영역 외경 ⌽12, MNs pitch 750 um로 EHWA diamond Ltd에서 제작하여 사용하였으며, 니들 원판의 개략도와 이미지는 Figure 1에 나타내었다.

또한, MNs의 PDMS(polydimethylsiloxane) 탄성몰드를 제작하기 위 해 ELASTOSIL® RT 623 A와 ELASTOSIL® RT 623 B(Wacker chemicals Inc., Korea) 그리고 AK 35(C) (Wacker chemicals Inc., Korea)를 구입하여 사용하였다.

2.2. 마스터 및 몰드 제작

MNs 탄성 몰드를 제작하기 위해 사각뿔 니들 원판(master)을 ⌽35 페트리디쉬(petri dish)에 넣고 고정시킨 후, ELASTOSIL® RT 623 A 와 ELASTOSIL® RT 623 B 그리고 AK 35(C) 세 가지 성분의 시약을 함량비에 따라 RT 623 A와 B의 성분 비율은 A:B = 90:10 으로 AK 35 C의 함량비를 A와 B의 전체 % 함량에 대하여 30% 함량비로 첨가 하여 PDMS 탄성몰드 용액을 제조하였다. 니들의 원판(master)이 제 조된 PDMS 탄성몰드의 용액으로 채워질 때까지 부운 후, 진공챔버 (550 Torr/30분)에서 기포를 제거한 후에, 60 ℃의 오븐에서 6시간 이 상의 고형화를 진행한다. 최종적으로 니들 원판(master)에서 몰드를 분리(demolding)하여 유연한 탄성몰드를 제작한다. PDMS 탄성몰드 가 너무 hard한 물성을 가지면 원판에서 몰드를 분리 시에 구부러짐에 대한 몰드의 피로도(bending fatigue)의 증가로 인하여 탄성몰드의 손 상을 가져올 수 있어 주의가 필요하다. MNs의 탄성몰드 제작은 이전 에 발표된 논문을 참조하여 제작하였다[22].

2.3. 초상자성 마이크로 니들(SMNs)의 제작

SIONs를 포함하는 HA용액과 CMC용액을 각각 제조하기 위해 SIONs 0.25% (w/w), 0.5% (w/w), 1% (w/w)를 D.D.I. water (3차증류수)에 넣 어 sonicator (360 W/60 Hz/5 min, POWERSONIC405, HWASHIN, Korea)로 각각 분산시킨 후, 각각의 SIONs 0.25%, 0.5%, 1% 용액에 HA 5% (w/w)와 CMC 10% (w/w)로 각각 첨가하여 HA-SMNs와 CMC-SMNs 제작을 위한 용액을 각각 제조하고, 제조된 용액은 PDMS 탄성몰드의 니들 구조 안으로 도포될 수 있도록 몰드 표면에 용액을 각각 0.5 g씩 도포하고 도포된 용액을 넓게 편 후, 원심분리기 (1000 rpm/1 min, Labogene 1248R, Korea)와 진공챔버(550 mmHg/20 min)을 이용하여 기포를 제거하여 탄성몰드에 완전히 채운다. 용액이 채워진 탄성몰드를 상온하에서 desiccator (RH20%, KDD-50D, GOODS GOOD, Korea)을 이용하여 overnight 건조시킨 뒤 PDMS 탄성몰드와 성형된 HA-SMNs와 CMC-SMNs를 각각 분리(demolding)하여 니들 원판(master)의 형태와 동일한 형상을 가진 SIONs 0.25%, 0.5%, 1% 를 함유한 0.25% HA-SMNs, 0.5% HA-SMNs, 1% HA-SMNs와 0.25% CMC-SMNs, 0.5% CMC-SMNs, 1% CMC-SMNs 샘플을 각각 제작하 였다. 또한, SMNs의 특성을 비교 분석하기 위해 SIONs를 함유하지 않은 MNs를 상기 동일한 공정을 이용하여 제조하였다. SMNs의 제작 공정도와 제조된 SIONs를 함유하지 않은 MNs과 SIONs를 함유한 SMNs의 이미지를 Figure 2에 나타내었고, 모든 MNs의 제작은 이전 에 발표된 논문을 참조하여 제작하였다[4, 17, 18, 22].

2.4. 초상자성 마이크로 니들(SMNs)의 특성 분석

SMNs의 형상(morphology)을 측정하기 위해 전자주사현미경(scanning electron microscopic, SEM, S-4800, Hitachi, Japan)를 이용하여 확인 하였고, HA-SMNs와 CMC-SMNs에 함유된 SIONs의 농도에 따라 초 상자성의 자기 히스테리시스 곡(magnetic hysteresis Curve) 특성을 조 사하고, 자화율(magnetization) 특성을 분석하기 위해 SQUID-VSM (superconducting quantum interference device-vibrating sample magnetometer, 300 K, MPMS3 in KBSI)를 가지고 측정하였다. 또한, HA-SMNs 와 CMC-SMNs의 SIONs 함유 농도에 따른 FMMD (Frequency mixing magnetic detection, MagRay2000, ㈜맥솔루션) 측정을 통해 magnetic signal intensity를 조사하여 SMNs의 자성특성을 분석하였다. 제조한 SMNs를 TDDS로 향후 응용되기 위해서는 피부 각질층을 뚫고 삽입 되어야 하기 때문에 고분자 인조막(Strat-M^™ Membrane, Millipore)과 바이오 막인 porcine back skin (Micropig® Franz Cell Membrane), FCM, Apures, Korea)에 대한 피부 투과도(permeability intensity)를 측 정하여 기계적 특성을 확인하였다.

3. 결과 및 고찰

HA-SMNs와 CMC-SMNs에 함유된 SIONs의 농도 0, 0.25, 0.5, 1% 에 대한 각각의 형상을 SEM을 통해 측정하였다. Figure 3에 나타낸 측정 결과에서 확인할 수 있듯이 SIONs의 농도의 증가에 따라 니들 제조 시 표면으로 산화철 입자의 분출이나 표면 상태를 변형시켜 제 형의 미성형 또는 형상에 영향을 미치는 지를 확인하였으나, 형상의 극격한 변화나 표면 상태의 변화는 확인되지 않았으며, 니들의 top부 의 sharpness도 마스터 형상 대비하여 변화는 확인되지 않아 SIONs의 농도에 따른 HA-SMNs와 CMC-SMNs가 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다. 하지만, CMC-SMNs와는 달리 HA-SMNs의 경우 니들의 하단 부에서 상단부로 가면서 상단부의 형상의 중심축을 기준으로 미세하 게 휘어지는 형상의 모양이 관찰되었는데, 이는 니들 성형 후에 몰드 에서 분리(demolding) 이형 되는 공정상에서 발생한 demolding effect 이거나, HA와 CMC의 소재의 특성에 따른 탄성율(modulus)로 인한 현상으로 추정될 수는 있으나, 이러한 현상에 관한 연관성은 더 연구 가 진행되어 해석될 필요가 있다.

HA-SMNs와 CMC-SMNs에 함유된 SIONs의 농도에 따라 SMNs의 자성특성을 분석하기 위해 자화율의 변화와 자력에 대한 신호감도의 변화를 측정하였다. SMNs제형 제조 후에도 초기 SIONs가 가지는 초 상자성의 히스테리시스 곡선(hysteresis curve) 특성이 유지되는지를 확인하였다. Figure 4(a)는 SIONs의 자화율 측정 결과이며, Figure 4(b) 는 SIONs의 농도에 따른 HA-SMNs와 CMC-SMNs의 자화율 측정 결 과이다. Figure 4(b)에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 SIONs의 함량비 가 증가됨에 따라 자화율의 증가가 나타남을 확인할 수 있으며, SIONs의 초상자성의 히스테리시스 곡선 특성이 MNs제형 제조 후에 도 초상자성의 히스테리시스 곡선 특성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한, Figure 5(a) 결과에서 확인할 수 있듯이 FMMD 방식을 통해 SIONs의 함유 정도와 함량비에 따른 자력에 대한 신호 감응 변화를 확인하여 함량비의 증가함에 따른 신호변화를 확인할 수 있었으며, linear fitting 함수를 통해 R² = 0.99 수준의 비례적인 경향임을 알 수 있었다. SIONs의 농도 1%의 자력에 대한 값을 100% 기준으로 환산 하여 magnetic signal intensity로 변환하여 경향을 상대 비교하면 Figure 5(b)에서 처럼 SMNs안에 SIONs가 비례적인 농도 비율로 자력 에 대하여 증가함을 확인할 수 있어 자성 특성에 대한 분석을 통해 MNs 안에 SIONs가 함유되어 있을 것으로 판단된다. 하지만, 니들 단 위 부피에 대한 SIONs의 더 정량적인 분석은 더 많은 추가적인 연구 가 진행되어 해석되어질 필요가 있다. 자성에 대한 측정과 분석은 이 전의 논문을 참조하여 진행하였다[4, 7, 8, 23-25].

HA-SMNs와 CMC-SMNs에 함유된 SIONs의 농도에 따른 SMNs의 피부 침투를 위한 기계적 강성을 확인하기 위해 고분자 막과 바이오 막을 투과한 니들 수를 조사하여 피부 투과성(skin permeability) 평가 를 수행하였다. 1차적으로 고분자 인조막(polymer membrane, Start M Membrane)에 대한 SIONs의 농도에 따른 투과율(permeability intensity) 를 측정하였다. 원형의 고분자 인조막인 Start M Membrane에 HA-SMNs와 CMC-SMNs를 올려놓고 상온하에서 10초간 5 kgf로 가 압 후에 각각의 SMNs를 제거하고, 전체 니들 수 대비하여 투과된 수 를 광학현미경으로 확인하여 백분율(%)로 계산하여 나타내었다.

Figure 6과 Table 1에서 확인할 수 있듯이 고분자 인조막에 대한 투 과율은 SIONs의 함유 정도와 상관없이 100%의 투과성을 보인다. 이 는 고분자 막의 구조가 단단한 표면과 기공질 내부 구조를 가지고 있 어 니들의 물리적인 강성이 막을 투과하기에 충분한 강도를 가지고 있음을 알 수 있었다. 이에 표면이 soft하고 내부의 구조가 피부의 구 조와 유사한 막에 대한 투과성을 확인하기 위해 2차적으로 바이오 막 인 돼지 등 피부(porcine back skin) Micropig® FCM를 이용하여 평가 하였다. -25 ℃에서 보관된 멸균 처리되어진 돼지 등 피부(porcine back skin, 1.2 T, 20 mm × 20 mm 면적)를 해동 후에 60분 동안 상온 하에서 건조하여 피부 표면의 수분함량을 최소화하고, 돼지 등 피부 의 모서리를 최대한 당겨 팽팽함을 유지하여 실제 사람의 피부 모델 과 최대한 유사한 형태로 준비하여 피부 투과성을 평가하였다. 또한, 돼지 등 피부의 수분을 거즈(gauze)로 제거하고 HA-SMNs와 CMCSMNs에 함유된 SIONs의 농도에 따른 SMNs를 수직 방향으로 상온 에서 10초간 5 kgf으로 누른 후 니들을 제거하고, trypan blue 0.4% (w/w)를 도포한 뒤 10분 동안 염색하고서 남은 염색약을 제거하고, MNs이 돼지 등 피부를 투과하였는지 전체 니들 수 대비하여 투과된 수를 광학현미경으로 확인하여, 백분율(%)로 계산하여 나타내었다. Figure 7과 Table 1에서 확인할 수 있듯이, 모든 SIONs 농도에서 90% 이상의 투과율을 보였으며, 농도가 증가함에 따라 투과율의 유의차는 크게 확인되지 않아 SIONs의 1%까지의 농도는 니들의 강성에 영향 을 미치는 부분이 거의 없는 것으로 판단된다. 또한, HA 대비하여 CMC에서 미세한 투과율의 증감을 확인할 수 있었으며, 이는 니들의 형상 분석을 통해 보였던 HA와 CMC의 소재의 특성에 따른 탄성율 (modulus)로 인한 현상으로 추정될 수는 있으나, 이러한 현상에 관한 연관성은 더 연구가 진행되어 해석되어질 필요가 있다.

4. 결 론

본 연구를 통해 SIONs의 농도에 따라 HA-SMNs와 CMC-SMNs를 제조한 후, 형상 분석과 자성의 특성을 비교 분석하였고, TDDS로의 응용 가능성을 간접적으로 확인하기 위해 고분자 막과 바이오 막을 통한 피부 투과율을 평가하였다. SIONs의 농도에 따라 형상의 유의차 는 확인되지 않았으며, 자성의 특성 분석을 통해 SMNs를 제조하는 공정 과정에서 HA와 CMC 소재의 배합으로 인한 자성의 특성이 변형 되지 않고 초상자성을 유지함을 알 수 있었다. 또한, 투과율 분석을 통해 모든 막에 대하여 90% 이상의 투과율을 확인되어 TDDS 응용분 야로 확대 적용될 수 있을 것으로 기대되며, SIONs의 농도에 따라 초 상자성의 거동과 자력에 대한 신호감도의 비례적인 반응 경향과 특성 통해 1.5 T 이상의 MRI 조건하에서 SMNs가 충분히 감지될 것으로 판단된다[11, 26-27]. 본 연구 결과를 통해 얻는 기반기술과 결과들은 MRI를 이용한 질병을 진단하거나 동시에 치료가 가능한 분자영상 (molecular image) 분야의 소재 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.