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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)
Applied Chemistry for Engineering Vol.32 No.3 pp.312-319
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2021.1034

Preparation and Characterization of Reduced Graphene Oxide with Carboxyl Groups-Gold Nanorod Nanocomposite with Improved Photothermal Effect

Seunghwa Lee*, So Yeon Kim*,**†
*Graduate school of Energy Science and Technology, Chungnam National University, Dajeon 34134, South Korea
**Department of Chemical Engineering Education, College of Education, Chungnam National University, Daejeon 34134, South Korea
†Corresponding Author: Chungnam National University, Department of Chemical Engineering Education, College of Education, Daejeon
34134, South Korea Tel: +82-42-821-5892 e-mail: kimsy@cnu.ac.kr
April 16, 2021 ; April 28, 2021 ; April 29, 2021

Abstract


Photothermal therapy is a treatment that necrotizes selectively the abnormal cells, in particular cancer cells, which are more vulnerable to heat than normal cells, using the heat generated when irradiating light. In this study, we synthesized a reduced graphene oxide with carboxyl groups (CRGO)-gold nanorod (AuNR) nanocomposite for photothermal treatment. Graphene oxide (GO) was selectively reduced and exfoliated at high temperature to synthesize CRGO, and the length of AuNR was adjusted according to the amount of AgNO3, to synthesize AuNR with a strong absorption peak at 880 nm, as an ideal photothermal agent. It was determined through FT-IR, thermogravimetric and fluorescence analyses that more carboxyl groups were conjugated with CRGO over RGO. In addition, CRGO exhibited excellent stability in aqueous solutions compared to RGO due to the presence of carboxylic acid. The CRGO-AuNR nanocomposites fabricated by electrostatic interaction have an average size of ∼317 nm with a narrow size distribution. It was confirmed that under radiation with a near-infrared 880 nm laser which has an excellent tissue transmittance, the photothermal effect of CRGO-AuNR nanocomposites was greater than that of AuNR due to the synergistic effect of the two photothermal agents, CRGO and AuNR. Furthermore, the results of cancer cell toxicity by photothermal effect revealed that CRGO-AuNR nanocomposites showed superb cytotoxic properties. Therefore, the CRGO-AuNR nanocomposites are expected to be applied to the field of anticancer photothermal therapy based on their stable dispersibility and improved photothermal effect.


Gold nanorod , Reduced graphene oxide , Photothermal therapy , Synergistic effect

향상된 광열 효과를 갖는 카르복실화된 환원 그래핀옥사이드-골드나노막대 나노복합체의 제조 및 특성 분석

이 승화*, 김 소연*,**†
*충남대학교, 에너지과학기술대학원
**충남대학교, 사범대학 화학공학교육과

초록


광열 치료(photothermal therapy)란 빛을 조사하여 열을 발생시킴으로써 정상세포보다 열에 약한 비정상 세포, 특히 암 세포를 선택적으로 괴사시키는 치료법이다. 본 연구에서는 광열 치료를 위한 카르복실화된 환원 그래핀옥사이드(reduced graphene oxide with carboxyl groups, CRGO)-골드나노막대(gold nanorod, AuNR) 나노복합체를 합성하고자 하였다. 이를 위해 그래핀옥사이드(graphene oxide, GO)를 고온에서 선택적으로 환원, 박리하여 CRGO를 합성하였고, AgNO3의 양에 따라 AuNR의 길이를 조절하여 880 nm에서 강한 흡광 특성을 나타내는 AuNR를 합성하여 광열 인자로 사용하였다. 일반적인 방법으로 환원된 RGO에 비해 CRGO에 상대적으로 많은 카르복실기가 결합되어 있음을 FT-IR, 열 중량 분 석 및 형광 분석을 통해 확인하였다. 또한, RGO에 비해 많은 carboxyl group이 결합된 CRGO는 수용액상에서 우수한 안정성을 나타내었다. 정전기적 상호작용을 통해 합성된 CRGO-AuNR 나노복합체는 약 317 nm의 균일한 크기와 좁은 크기 분포를 보였다. CRGO-AuNR 나노복합체는 두 가지 광열 인자인 CRGO와 AuNR의 synergistic effect로 인하여 조 직 투과도가 우수한 근적외선 880 nm 레이저의 조사에 의한 광열 효과가 AuNR보다 2배 이상 향상 되는 것을 확인하 였다. 또한, 광열 효과에 의한 암세포 독성 분석 결과, CRGO-AuNR 나노복합체가 가장 우수한 세포 독성 특성을 나타 내었다. 따라서 CRGO-AuNR 나노복합체는 안정된 분산성과 향상된 광열 효과를 기반으로 항암 광열 요법 분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.


    1. 서 론

    현대 의학에서 대부분의 암은 외과적 수술, 항암제 기반의 화학 요 법과 방사선 요법 등을 통해 치료되고 있지만 이런 치료법들은 약물 의 비 특이적 반응에 의해 암 세포만 선택적으로 공격하기 어렵다. 결 국 암 세포에 도달하지 못한 약물이 정상 조직에서 반응하여 구토, 탈 모, 신경 쇠약 등 다양한 신체적, 정신적 부작용을 초래한다[1-4]. 최 근 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 빛을 활용한 광열 치료 (photothermal therapy)가 주목 받고 있다. 광열 치료는 빛을 통해 광열 인자의 국부적인 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance) 을 유도하여 electron-phonon과 phonon-phonon 결합으로 발생 된 비복사 이완을 통해 원하는 국소 부위에만 열을 전달하여 암을 제 거하는 기술이다[5]. 광열 치료는 반복 치료가 가능하고 비침습적 특 성으로 인해 외과적 시술과는 달리 치료 후에 외상이 남지 않고, 환자 의 빠른 회복 속도를 기대할 수 있다[6,7].

    대표적인 광열 인자로는 금, 은 등의 다양한 나노 입자들이 있으며 특히 골드나노막대(gold nanorod, AuNR)는 다른 골드나노입자들보다 합성법이 간단하고 길이를 조절하기 쉽다. 또한 광열 변환 효율(photothermal conversion efficiency)이 높고 독성이 거의 없어 생물학적 이미징을 위한 조영제, 약물 전달 매개체 등으로 연구되고 있다[8,9]. 광열 치료에는 보편적으로 700~1000 nm 파장의 근적외선(near-infrared) 영역의 광원을 사용한다. 파장에 따라 빛 투과도가 다르기 때문 에 사용 목적에 적합한 레이저를 선택하는 것이 매우 중요하다. 여드 름 치료와 같은 피부 미용을 목적으로 하는 경우, 주로 400~600 nm의 단파장 레이저로 진피층을 자극하지만 침윤성 성장(infiltrative growth) 하는 대부분의 암세포는 진피층보다 더 깊은 근육 조직에서 주로 전 이되므로 높은 투과도의 장파장 레이저가 요구된다[10].

    2004년에 처음 발견된 그래핀(graphene)은 3차원 구조의 흑연(graphite flake)에서 분리한 2차원 평면 육각 고리 구조의 탄소 동소체이 다. 그래핀은 강철보다 기계적 강도가 200배 강하고, 전기 전도도는 실 리콘보다 100배 이상 높으며, 구리보다 13배 향상된 열 전도율을 가 진 꿈의 소재라고 알려졌다[11,12]. 이러한 뛰어난 물리적, 화학적 특 성으로 배터리, 촉매, 디스플레이, 분리막 등의 다양한 산업에서 활발 히 연구되고 있다. 하지만 그래핀의 생체 적합 기준이 정립되지 않고 모호하여 안전성의 문제가 해결되지 않아 지난 수 년 동안 의료, 생명 공학 관련 연구자들에게 많은 관심을 받지 못하였다. 그럼에도 그래 핀을 바이오산업에 도입하려는 많은 시도들이 있었으며 최근 들어, 생 체 내 안전성을 입증하는 여러 연구 결과들이 발표되고 있다[13-15]. 또한 2차원 평면 구조인 그래핀은 탄소나노튜브(carbon nanotube), 풀 러렌(fullerene) 등과 같은 다른 탄소 동소체들보다 넓은 비 표면적을 가지기 때문에 많은 양의 약물을 loading할 수 있고 다양한 관능기 (functional group)를 통한 기술 응용이 가능해 바이오산업에서의 가치 가 점점 더 높아지고 있다[16].

    Hummers’method는 가장 대표적인 그래핀옥사이드(graphene oxide) 합성법으로 흑연을 과망간산칼륨, 황산과 함께 넣고 산화시켜 얻는다. 그래핀옥사이드를 광열 인자로 사용하기 위한 많은 연구진들의 노력 에도 불구하고 800 nm 영역에서 낮은 흡광도를 나타내었다. 반면에, 환원 그래핀옥사이드(reduced graphene oxide, RGO)는 800 nm 영역 에서 GO보다 더 높은 흡광도가 나타나므로 광열 효과는 뛰어나지만 줄어든 oxygen functional group으로 인해 침전이 발생하여 지속적으 로 열을 내기 어려운 문제가 있었다. 이러한 이유로 modification되지 않은 RGO는 몸 속에 들어가면 배출되지 않아 장기에 축적될 수 있으 며 심한 경우 염증 및 조직 괴사를 유발할 수 있다[17-19].

    따라서 본 연구에서는 기존에 치료용으로 주로 사용하던 808 nm 레 이저보다 생체 조직의 투과 특성이 보다 우수한 880 nm 레이저를 사 용하여 광열 치료가 가능하도록 하기 위해, AgNO3의 첨가량을 조절 한 seeded growth method를 사용하여 광열 인자로서 880 nm에서 높 은 흡광도를 갖는 AuNR를 합성하였다. 또한, RGO의 분산성을 향상 시키기 위해 선택적 환원 및 박리 과정을 통해 다수의 카르복실기가 결합된 CRGO를 합성하였다. 두 가지 광열 인자인 CRGO와 AuNR를 정전기적 상호작용을 통해 결합시킨 CRGO-AuNR 나노복합체를 제 조하여 효과적인 광열 치료를 위한 약물 전달체로서의 응용 가능성을 고찰하였다(Figure 1).

    2. 실 험

    2.1. 시약

    Graphite flake (~325 mesh, 99.8%)는 Alfa Aeaser (Ward Hill, MA, USA)에서 구입하였으며 hydrogen peroxide (H2O2), potassium permanganate (KMnO4), sulfuric acid (H2SO4), hydrochloric acid (HCl), sodium hydroxide (NaOH)는 Samchun Pure Chemical (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다. Chloroacetic acid (CAA), gold(III) chloride hydrate (HAuCl4), hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), L-ascorbic acid (AAc), silver nitrate (AgNO3), sodium borohydride (NaBH4), hydrazine monohydrate (N2H4)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), RPMI 1640 medium, penicillin-streptomycin, 025% trypsin-EDTA는 HyClone Laboratories (Logan, UT, USA)에서 구입하였으며 cell viability assay kit는 DoGenBio (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 시약은 별도의 정제과정을 거치지 않고 그대로 사 용하였다.

    2.2. AuNR 합성

    본 연구에서는 seeded growth method로 AuNR를 합성하였다[20]. 먼저 seed 용액을 제조하기 위해 10 mM의 HAuCl4 250 μL와 100 mM 의 CTAB 10 mL를 300 rpm으로 섞어준 뒤, 곧바로 10 mM의 차가운 NaBH4 600 μL를 넣고 5 min 동안 반응시켰으며 제조된 seed 용액은 pale brown 색상이었다. 다음으로 100 mM의 CTAB 100 mL와 10 mM의 HAuCl4 5 mL를 교반하면서 10 mM의 AgNO3 1 mL를 첨가하 였다. 1 min 동안 교반한 뒤에 1M의 HCl 2 mL와 100 mM의 AAc 800 μL를 첨가하였다. 반응물이 무색으로 변하면 seed 용액 240 μL를 넣고 3 h 동안 어두운 환경에서 느린 속도로 교반하였다. 3 h 뒤, 생성 물은 짙은 보라색을 띄었으며 모양이 불균일한 골드나노입자들을 걸 러내기 위해 3500 rpm에서 15 min 간 2회 원심 분리하였다(shape separation). 생성물에 포함된 과량의 CTAB는 14000 rpm에서 20 min 간 3회 원심 분리하여 제거하였다.

    2.3. CRGO-AuNR 나노복합체의 제조

    2.3.1. GO의 합성

    GO는 Hummers’ method를 사용하여 합성하였다[21]. 우선 흑연 250 mg과 H2SO4 7.5 mL를 500 rpm으로 15 min 동안 천천히 교반하였다. 다음으로 산화제인 KMnO4 750 mg을 넣고 50 ℃에서 3 h 동안 섞어 주며 흑연이 충분히 산화될 수 있도록 하였다. 이 과정에서 첨가된 KMnO4 양으로 GO의 oxidation degree를 조절할 수 있다. 이어서 증 류수 17.5 mL를 천천히 넣고 15 min 동안 교반하였다. 추가로 증류수 75 mL를 넣어주고 상온에서 식혀주며 5 min 동안 교반하였다. 반응 물이 충분히 식으면 H2O2 10 mL를 천천히 첨가하고 10 min 동안 교 반하여 반응을 종결시켰다. 이때, 반응물은 어두운 갈색에서 밝은 황 갈색으로 변했다. 반응물에 남아 있는 소량의 미반응물을 제거하기 위해 10% HCl 125 mL를 넣고 10 min 동안 충분히 교반하였다. 마지 막으로 5000 rpm에서 7 min 동안 2회 원심 분리하여 액상의 고순도 GO를 얻었다. 마지막으로 증류수를 섞고 5000 rpm에서 7 min 동안 원 심 분리하여 생성물에 남아 있는 소량의 HCl을 완전히 제거하였다. 완 성된 GO는 24 h 동안 oven에서 건조하여 고상의 GO를 얻었다.

    2.3.2. RGO의 합성

    RGO는 hydrazine-reduction method를 사용하여 합성하였다[22]. 우 선 증류수로 희석한 3 mg/mL 농도의 GO 30 mL를 reflux condenser가 연결된 three-neck flask에 넣어 준비하였다. 준비된 GO에 곧바로 환 원제인 N2H4 30 μL를 넣었다. 12 h 동안 80 ℃ oil bath에서 500 rpm 으로 교반하였다. GO가 환원되는 과정에서 검은 powder 형태의 RGO 가 생성되었다. 생성물은 상온에서 충분히 식힌 뒤, 3000 rpm에서 10 min 동안 원심 분리하였다.

    2.3.3. CRGO 및 CRGO-AuNR 나노복합체의 합성

    CRGO를 합성하기 위해 3 h 동안 probe ultrasonicator (VC-505, Sonics and Materials. USA)로 박리한 GO를 준비하였다[23]. 이어서 박리된 2.5 mg/mL의 GO 60 mL를 NaOH 1.4 g, CAA 1 g과 함께 넣 고 2 h 동안 80 ℃에서 probe ultrasonicator (20 kHz)로 박리하였다. 다음으로 반응을 종결시키기 위해 20% HCl 50 mL를 넣고 5 min 동 안 교반하였으며 생성물은 4000 rpm에서 20 min 동안 원심 분리하였 다. 증류수를 사용해 다시 한 번 원심 분리하여 CRGO를 얻었다.

    CRGO-AuNR 나노복합체는 0.5 mg/mL AuNR와 1 mg/mL CRGO 를 각각 1 : 2의 volume ratio로 500 rpm으로 24 h 동안 교반하여 제조 하였다. 이 과정에서 CRGO가 뭉치는 것을 방지하기 위해 AuNR 용 액을 천천히 적하하면서 교반하였다.

    2.4. Characterization

    열 중량 분석(thermogravimetric analysis, TGA) (TGA N-1000, Shinco Com., Korea)을 통해 흑연, GO, RGO, CRGO 내에 존재하는 각각의 oxygen functional group을 정성적으로 비교하였다. GO, RGO, CRGO의 reduction degree는 형광 분석기(spectro fluorophotometer) (RF-6000, Shimadzu, Columbia, United States)를 통해서 비교하였다. 동적광산란광도계(dynamic light scattering, DLS) (ELS-Z, Otsuka, Japan)의 입도분석기를 통해 CRGO의 크기를 관찰하였다. 표면 전위 (zeta potential) (ELS-Z, Otsuka, Japan) 분석을 통해 AuNR와 CRGO 의 결합 원리를 확인하였다. 자외선-가시광선 분광광도계(UV-visible spectrophotometer, UV-vis) (UVmini-1240, Shimadzu, Japan)로 AuNR 와 CRGO의 흡광도를 확인하였다. AuNR, GO, CRGO-AuNR 나노복 합체의 morphology는 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM) (TecnaiG2F30, FEI, Netherlands)을 통해 관찰하였다. 샘 플들의 광열 효과를 비교하기 위해 880 nm 근적외선 레이저(MDL-N- 880 nm, CNI, Changchun, China)를 사용하였으며 열화상 카메라 (Flirone Pro, FLIR Systems Inc., USA)로 실시간 온도 변화를 관찰하 였다.

    2.5. 광열 효과

    광열 효과를 확인하기 위해 증류수와 동일한 농도의 GO, CRGO, AuNR, CRGO-AuNR 나노복합체 샘플 750 μL를 각각 micro-tube에 넣고 1 W/cm2 세기의 880 nm 레이저로 10 min 동안 조사하였다. 샘 플의 온도 변화를 열 화상 카메라를 통해 실시간으로 관찰하였으며 2 min 간격으로 온도를 확인하여 Flir Tools software (Flir Tools, FLIR Systems Inc., USA)로 분석하였다.

    2.6. 세포 독성 실험

    96 well plate에 A549 세포를 한 well당 1 × 104개씩 분주하여 37 ℃의 incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 24 h 뒤에 다양한 농도 (0, 12.5, 25, 50 μg/mL)의 CRGO, AuNR, CRGO-AuNR 나노복합체가 포함된 배지를 넣어주고 4 h 동안 배양하였다. 10% PBS로 세척한 후 에 신선한 배지로 교체하여 37 ℃ incubator에서 추가로 배양하였다. 24 h 후, CCK-8 assay를 통해 샘플의 dark toxicity를 확인하였다. 또 한, 레이저 조사에 의한 샘플의 phototoxicity를 확인하기 위해 동일한 농도의 CRGO, AuNR, CRGO-AuNR 나노복합체로 처리한 A549 세포 를 4 h 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후에 신선한 배지로 교체하였 으며 1W/cm2 세기의 880 nm 레이저를 5 min 동안 조사한 뒤, 37 ℃ incubator에서 배양하였다. 24 h 후, CCK-8 assay를 통해 각 샘플의 세 포 독성을 측정하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. AuNR의 제조

    2005년, Guyot-Sionnset 그룹은 은 이온(Ag+)과 CTAB로 코팅된 seed 용액을 사용하여 AuNR가 성장할 때, AuNR 측면이 Au(110)면, 막대 의 양 끝이 Au(100)면을 이루는 것을 밝혔으며 은 이온이 막대의 양 끝보다 측면에 더 빠르게 증착되기 때문에 첨가되는 은 이온이 많아 질수록 AuNR의 길이가 길어진다고 보고하였다[24]. 본 연구에서는 880 nm 근적외선 파장에서 가장 우수한 광열 효과를 나타내기 위해 AgNO3의 첨가량을 조절하여 적절한 길이의 AuNR를 제작하고자 하 였다. 10 mM 농도의 AgNO3를 각각 300, 500, 1000 μL씩 넣어 다양 한 길이의 AuNR를 합성하였고 각각의 UV-visible spectrum의 흡광 특성을 비교하였다[Figure 2(A)]. 가장 적은 양의 AgNO3가 첨가된 AuNR(670)은 672 nm에서 흡광 피크가 나타났으며 AuNR(780)은 784 nm에서 관찰되었다. 가장 많은 양의 AgNO3가 첨가된 AuNR(880)은 885 nm에서 흡광 피크가 나타났다. 즉, localized surface plasmon resonance에 의해 나타나는 peak1은 약 510 nm 부근에서 관찰되었으나 첨가된 AgNO3 양이 많아질수록 peak 2가 red-shift되는 것을 관찰할 수 있었다. Figure 2(B)에는 TEM 분석을 통해 morphology를 분석한 결 과를 나타내었다. AgNO3가 가장 적게 들어간 AuNR(670)의 평균 길이 는 약 32 nm로 가장 짧았으며 약 39 nm의 평균 길이를 가진 AuNR(780)은 AuNR(670)보다 상대적으로 길어졌지만 아직 완전히 성장하지 못해 모양이 삐뚤어지거나 길이가 짧은 AuNR가 다수 관찰 되었다. 최종적으로 선택된 AuNR(880)은 전반적으로 약 50 nm의 비 슷한 길이를 가지며 균일한 모습을 보였다. AuNR의 너비는 약 15 nm 로 일정하게 유지되면서 AgNO3의 첨가량이 증가함에 따라 aspect ratio는 각각 2.3, 2.8, 3.5로 점차적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이번 연구에서는 880 nm 레이저와 흡광도가 가장 일치하고 aspect ratio 는 3.9 : 1이며, 평균 길이와 너비 각각 약 55와 14 nm인 AuNR(880)를 사용하였다.

    3.2. CRGO의 제조

    Figure 3(A)에는 GO, RGO, CRGO의 합성을 확인하기 위한 FT-IR 분석 결과를 나타내었다. 3430 cm-1에서 carboxyl group에 존재하는 -O-H stretching vibration이 관찰되고 1740 cm-1에서 C=O stretching vibration이 관찰되었다. GO는 carboxyl group뿐만 아니라 hydroxyl group이 많기 때문에 -O-H stretching vibration intensity가 가장 강했으 며 이는 oxidation degree가 가장 크다는 것을 의미한다[Figure 3(A)(a)]. 반대로 Figure 3(A)(b)의 RGO는 상대적으로 3430 cm-1에서의 약한 -O-H stretching vibration이 관찰되었고 1740 cm-1에서의 C=O stretching vibration은 완전히 사라진 것을 확인하였다. CRGO의 -O-H stretching vibration는 GO와 RGO의 중간 정도의 intensity를 보였으며 RGO 에서 관찰되지 않았던 1740 cm-1에서의 C=O stretching vibration이 새 롭게 관찰되어 환원 이후에 carboxyl group이 생성된 것을 확인하였다.

    본 연구에서는 흑연, GO, RGO, CRGO의 oxygen functional group을 비교하기 위해 TGA analysis을 실시하였으며 특정 온도 구간에서 수 분이 증발하거나 화학 결합이 분해되어 줄어든 무게를 관찰하였다 [Figure 3(B)]. 흑연은 온도가 최대 700 ℃까지 올라가는 과정에서 약 1.8%의 무게 손실을 보여 가장 우수한 thermal stability를 보였다 [Figure 2(B)(a)]. GO는 약 59.5%의 무게 손실을 보여 흑연보다 상대적 으로 불안한 thermal stability를 보였다. 148 ℃에서 GO는 sheet와 sheet 사이에 위치한 수분이 증발하여 약 19.2%의 무게가 손실되었다[25]. 또한 210 ℃에서 약 14.6%의 무게 손실이 관찰되었는데 이 구간은 열 에 의해 분해된 다수의 hydroxyl group, epoxy group과 같은 oxygen functional group이 제거되면서 나타난 결과이다[Figure 3(B)(d)][26,27]. RGO는 소량의 oxygen functional group이 열 분해되어 210 ℃에서 무 게가 약간 손실되었지만 다른 온도 구간에서의 눈에 띄는 변화는 없 었다[Figure 3(B)(b)]. CRGO도 마찬가지로 210 ℃에서 약간의 무게 손실이 나타났으며 특히 550 ℃에서 carboxyl group의 열 분해가 진행 되어 약 7.1% 정도의 무게가 추가로 감소하였다[Figure 3(B)(c)].

    또한 GO의 reduction degree는 photoluminescence를 통해서 정성적 비교하였다. GO는 대게 근적외선 영역(600~1100 nm)에서 낮은 에너 지의 적색 발광이 관찰된다. 반면에 RGO와 그래핀 양자점(graphene quantum dot, GQD)은 자외선을 조사하면 전자가 들뜨게 되고 상대적 으로 좁은 범위의 청색 발광이 관찰된다[28]. Figure 3(C)에서 GO는 약 623 nm를 main peak로 하여 광범위한 spectrum distribution을 보였으 며 RGO와 CRGO의 main peak는 각각 418, 449 nm로 blue-shift되었 다. Photoluminescence의 main peak는 GO의 reduction degree가 클수 록 blue-shift되는 경향을 보였다. 환원 이후에 spectrum이 blue-shift된 것은 환원 과정에서 sheet에 존재하던 defect site가 감소하고 sp2 탄소 영역이 증가하여 청색 발광 비중이 높아지기 때문이다[28]. 따라서 환 원 과정에서 hydroxyl group이 carboxyl group으로 치환된 CRGO는 상대적으로 RGO보다 sp2 탄소 복원력이 약하기 때문에 sheet의 defect site가 많아져서 상대적으로 덜 blue-shift된 것을 확인할 수 있었다.

    3.3. CRGO의 특성 분석

    크기가 작고 single-layer로 이루어진 GO는 수용액상에서 dispersion stability가 우수하기 때문에 장기에 축적되지 않고 대부분 체외 배출된 다. 따라서 생체 재료로서 GO를 사용하기 위해서는 micro-size의 multilayer GO를 nano-size의 single-layer GO로 박리해야 한다. 본 연구에 서는 GO를 체내에 주입하는 광열 치료제로 사용하기 위해 probe ultrasonicator로 박리하여 CRGO의 평균 크기를 약 300 nm까지 감소시 키고자 하였다. Figure 4(A)(a)에서 보듯이, 박리 되지 않은 CRGO는 평균 약 1848 nm의 크기를 보였으며 Figure 4(A)(b)의 probe ultrasonicator로 2 h 동안 박리한 CRGO는 약 585 nm를 나타내어 박리 전 보다 약 30% 가까이 줄어든 것을 관찰하였다. CRGO-AuNR 나노복합 체는 가장 작은 317 nm로 관찰되었으며 이는 AuNR와 정전기적 상호 작용에 의해 결합하는 과정에서 CRGO의 sheet가 shrink되었기 때문 에 전체적인 나노복합체의 크기가 줄어든 것으로 생각된다.

    시료의 분산 안정성을 예측하기 위해 각 샘플의 zeta potential을 측 정하여 Table 2에 나타내었다. AuNR는 약 +27 mV, CRGO는 약 -35 mV의 zeta potential이 관찰되었다. 각 샘플은 동일한 charge를 띄는 입자간 반발력으로 장기간 안정적으로 분산되었다. CRGO-AuNR 나노 복합체는 결합 과정에서 zeta potential이 상쇄되면서 약 -14 mV로 나 타났으며 이를 통해 두 입자가 electrostatic attraction으로 결합되었음 을 확인할 수 있었다.

    Figure 4(B)는 실험에 사용된 화합물들의 수용액상 dispersion stability를 비교하기 위해 동일한 농도로 준비된 액상의 화합물들을 각각 3 mL씩 cuvette에 넣고 24 h 동안 관찰한 사진이다. AuNR의 표면은 계면활성제인 CTAB로 coating되어 동일한 charge를 가진 입자들 사 이의 반발력으로 매우 안정적인 모습을 보였다[Figure 4(B)(a)]. GO는 24 h 후, 약간의 침전 현상을 보였지만 다수의 oxygen functional group으로 인해 대체적으로 고른 분산 상태를 유지하였다[Figure 4(B)(b)]. 하지만 RGO는 관찰 초기에 aggregation된 입자가 눈에 보일 정도로 이미 불안정한 모습이 관찰되었으며 24 h 후에 완전히 가라앉 았다. 이는 RGO가 환원되는 과정에서 oxygen functional group이 급 격하게 줄어들면서 입자들 대부분이 neutral charge를 띄게 되고, 그로 인해 입자 사이의 반발력이 약해졌기 때문으로 보인다[Figure 4(B)(c)]. CRGO는 늘어난 carboxyl group에 의해 sheet가 negative charge를 가 지므로 sheet 간에 강한 반발력이 작용하여 안정적인 분산이 가능했다 [Figure 4(B)(d)]. 다음으로 AuNR-CRGO 나노복합체의 분산 안정성을 AuNR-GO 복합체와 비교하였다. GO는 sheet가 전반적으로 매우 크기 때문에 AuNR를 넣자마자 aggregation되었으며 24 h 이후 완전히 가 라앉았다[Figure 4(B)(e)]. CRGO-AuNR 나노복합체는 probe ultrasonicator로 박리한 뒤에 원심분리 과정을 통해 한 번 더 nano-size의 sheet 만 분리했기 때문에 AuNR를 넣은 후에도 aggregation되지 않고 오랫동 안 안정적인 모습을 보였다[Figure 4(B)(f)]. 또한 CRGO-AuNR 나노복 합체는 수개월이 지난 이후에도 안정적으로 분산 상태를 유지하였다.

    합성된 AuNR(880)는 516 nm에서의 약한 흡광도 세기를 보였고 885 nm에서 강한 흡광 세기를 나타내었다. 885 nm에서의 관찰된 강한 세 기의 흡광도는 사용된 880 nm 레이저부터 우수한 광열 효과를 보여주 기에 충분했다[Figure 5(A)(a)]. GO는 C-C 결합의 π-π* transition에 의한 main peak가 230 nm에서 나타났으며, 동일한 결합의 n-π* transition에 의한 shoulder peak가 300 nm에서 관찰되었다[Figure 5(A)(b)] [4]. 한편, CRGO의 main peak는 230 nm에서 250 nm로 red-shift되었 으며 880 nm 부근에서 GO보다 더 높은 세기의 흡광도가 관찰되었다 [Figure 5(A)(c)]. CRGO-AuNR 나노복합체에서는 250, 516, 885 nm 총 세 개의 흡광도가 모두 관찰되었다[Figure 5(A)(d)]. TEM image를 통 해 GO, CRGO, CRGO-AuNR 나노복합체의 morphology를 관찰하였 다. GO와 CRGO는 일반적인 주름진 형태의 그래핀의 morphology가 관찰되었다[Figure 5(B)(a), (b)]. Figure 5(B)(c)의 CRGO-AuNR 나노 복합체는 약 300 nm의 size를 보였으며 AuNR가 그래핀 sheet에 박힌 형태로 존재하는 것으로 보여진다.

    3.4. CRGO-AuNR 나노복합체의 광열 효과 분석

    증류수, GO, CRGO, AuNR, CRGO-AuNR 나노복합체 샘플들의 초 기 온도를 23 ℃로 맞춘 후, 각각의 샘플에 1 W/cm2 세기의 880 nm 레이저를 10 min 동안 조사하며 온도 변화를 열화상 카메라를 통해 실시간으로 관찰하였다[Figure 6(A)]. 실험 결과, 증류수는 10 min 동 안 온도가 거의 변하지 않고 일정 했으며 결과적으로 약 2 ℃밖에 상 승하지 않았다[Figure 6(A)(a)]. GO는 30 ℃까지 상승했지만 레이저를 조사하는 동안 소량의 침전물이 관찰되었으며 이러한 이유로 100% 광열 효과를 발휘하기 어려웠을 것으로 생각된다[Figure 6(A)(b)]. GO 의 온도 상승폭이 작은 또 다른 이유로는 800 nm 영역에서의 흡광도 가 다른 샘플에 비해 현저히 낮기 때문으로 보인다. 본 연구에서 합성 한 CRGO는 880 nm에서 GO보다 약 10배 높은 흡광도를 나타내었듯 이 레이저를 조사한 지 단 6 min 만에 40 ℃까지 상승했으며 10 min 이 지난 뒤에 약 45 ℃에 도달하여 뛰어난 광열 효과를 보였다[Figure 6(A)(c)]. AuNR는 같은 세기의 레이저를 조사한 지 6 min 만에 CRGO의 최종 온도인 45 ℃까지 상승하였으며 최종적으로 약 48 ℃ 에 도달하였다. 단순히 온도 상승폭만 고려하면 AuNR가 광열 인자로 서 CRGO보다 의미 있는 결과를 보였다[Figure 6(A)(d)]. 마지막으로 CRGO-AuNR 나노복합체는 10 min 만에 59 ℃까지 상승하여 가장 빠 르고 큰 폭의 온도 상승을 보였다[Figure 6(A)(e)]. 특히 광열 치료제로 사용되기 위해 단백질 변성 온도인 45 ℃에 도달하는데 단 4 min 밖 에 걸리지 않아 가장 빠른 온도 상승을 보였다. Figure 6(B)는 열화상 카메라로 온도 변화를 관찰한 사진으로 CRGO-AuNR 나노복합체의 광 열 효과가 다른 샘플과 비교해서 가장 빠르고 높게 온도가 상승한 것을 확인할 수 있었다. CRGO-AuNR 나노복합체가 가장 빠르고 큰 폭의 온 도 상승을 보인 이유는 880 nm 부근에서 강한 세기의 흡광 피크를 갖 는 CRGO가 AuNR와 함께 synergistic effect를 발휘했기 때문이다.

    3.5. CRGO-AuNR 나노복합체의 세포 독성

    광열 효과에 의한 CRGO, AuNR 및 CRGO-AuNR 나노복합체의 세 포 독성을 비교하기 위해 각 샘플을 농도 별(0, 12.5, 25, 50 μg/mL)로 준비하여 A549 세포에 처리한 뒤, 880 nm 레이저를 조사하여 세포 생존률을 측정하였다. CRGO, AuNR 및 CRGO-AuNR 나노복합체의 dark toxicity를 분석한 결과, 가장 높은 50 μg/mL의 농도에서도 각각 89.4, 87.5, 88.2%의 세포 생존률을 보였다(Figure 7A). 즉, 레이저를 조사하지 않은 경우, 세포에 대한 심각한 독성은 나타나지 않음을 알 수 있다. 다음으로 샘플들의 phototoxicity를 분석하였으며 CRGO는 12.5 μg/mL에서 72.7%, 25 μg/mL에서 59.2%, 50 μg/mL에서 44.3% 의 세포 생존률이 관찰되었다. 즉, 샘플의 농도가 증가함에 따라 세포 의 생존률이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. AuNR은 상대적 으로 CRGO보다 향상된 광열 효과를 기반으로 12.5 μg/mL에서 61.3%, 25 μg/mL에서 44.1%, 50 μg/mL에서 31.3%의 세포 생존률을 보여 CRGO보다 뛰어난 암 세포 제거 능력을 보였다. CRGO-AuNR 나노복 합체의 경우, 12.5 μg/mL에서 52.9%, 25 μg/mL에서 28.7%, 50 μg/mL 에서 15.7%의 세포 생존률을 보여 세 가지 샘플 중에서 가장 우수한 광열 효과에 의한 세포 독성 특성이 관찰되었다. 특히, 가장 높은 농 도인 50 μg/mL에서는 CRGO, AuNR보다 각각 2.8, 1.9배 이상 암 세 포의 생존률이 감소된 것을 확인하였다(Figure 7B).

    본 연구에서 중점적으로 다룬 광열 치료 이외에도 CRGO-AuNR 나 노복합체와 광증감제의 결합을 통해 광열 치료와 광역학 치료를 동시 에 수행함으로써 효과적인 암 치료 요법으로 사용 가능할 것으로 생 각된다[29-31]. 그 외에도 CRGO는 구조적으로 넓은 비표면적을 가지 기 때문에 항암제를 loading하여 광 치료와 화학 요법을 결합한 복합 치료 요법에도 응용될 수 있을 것으로 기대된다[32-34].

    4. 결 론

    본 연구에서는 침윤성 성장하는 암을 효과적으로 치료하기 위한 광 열 치료 요법에 응용하기 위해 880 nm 레이저를 사용하는 새로운 광 열 인자로서 CRGO-AuNR 나노복합체를 합성하였다. AgNO3 첨가량 을 조절하여 880 nm에서 높은 흡광도를 갖는 AuNR를 합성하였으며 합성된 AuNR는 localized surface plasmon resonance로 인해 516과 885 nm에서 강한 흡광도가 관찰되었다. TGA와 photoluminescence 분석을 통해서 GO, RGO, CRGO의 reduction degree를 비교하였으며 FT-IR을 통해 CRGO에 존재하는 carboxyl group을 확인하였다. CRGO-AuNR 나노복합체는 약 317 nm의 크기와 좁은 크기 분포를 보였으며 수용액 상에서 안정적 분산성을 나타내었다. CRGO-AuNR 나노복합체는 두 광열 인자인 CRGO와 AuNR의 synergistic effect로 인해 1 W/cm2 세기 의 880 nm 레이저를 조사한 지 4 min 만에 단백질 변성 온도인 45 ℃ 에 도달하여 가장 뛰어난 광열 효과를 보였다. A549 세포를 사용한 세 포 독성 실험 결과, 50 μg/mL의 농도에서 CRGO와 AuNR은 각각 44.3 과 31.3%의 세포 생존률을 보인 반면, CRGO-AuNR 나노복합체는 상 대적으로 가장 낮은 15.7%의 세포 생존률이 관찰되어 우수한 세포 독 성 특성을 확인하였다. 특히, 조직 투과도가 우수한 근적외선 880 nm 레이저와 CRGO-AuNR 나노복합체를 활용한 광열 치료는 광원이 더 깊게 투과되어 깊은 곳에 자리 잡은 암을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서 합성한 CRGO-AuNR 나노복합체는 안 정적인 분산성과 향상된 광열 효과를 기반으로 한 새로운 광열 인자로 서 항암 광열 치료 및 다양한 바이오 분야에 응용될 것으로 기대된다.

    감 사

    이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2021R1H1A2011218).

    Figures

    ACE-32-3-312_F1.gif
    Schematic illustration of the synthesis of the CRGO-AuNR nanocomposite.
    ACE-32-3-312_F2.gif
    (A) UV absorption spectra of AuNRs according to the AgNO3; (B) TEM image of (a) AuNR(670), (b) AuNR(780), and (c) AuNR(880).
    ACE-32-3-312_F3.gif
    (A) FT-IR spectra of (a) GO, (b) RGO and CRGO; (B) TGA analysis curves of (a) graphite flake, (b) RGO, (c) CRGO, (d) GO; (C) photoluminescence of GO, RGO, and CRGO excited at 325 nm.
    ACE-32-3-312_F4.gif
    (A) Hydrodynamic size distribution of (a) CRGO before exfoliation, (b) CRGO after exfoliation, and (c) CRGO-AuNR nanocomposite; (B) dispersion stability of (a) AuNR, (b) GO, (c) RGO, (d) CRGO, (e) GO-AuNR composite, and (f) CRGO-AuNR nanocomposite.
    ACE-32-3-312_F5.gif
    (A) UV absorption spectra of (a) AuNR, (b) GO, (c) CRGO and, (d) CRGO-AuNR nanocomposite; (B) TEM image of (a) GO, (b) CRGO, and (c) CRGO-AuNR nanocomposite.
    ACE-32-3-312_F6.gif
    (A) Photothermal heating curve of (a) water, (b) GO, (c) CRGO, (d) AuNR, and (e) CRGO-AuNR nanocomposite with an 880 nm laser irradiation (1.0 W/cm2) for 10 min; (B) thermal image of (a) water, (b) GO, (c) CRGO, (d) AuNR, and (e) CRGO-AuNR nanocomposite with an 880 nm laser irradiation (1.0 W/cm2) for 10 min.
    ACE-32-3-312_F7.gif
    (A) In vitro cytotoxicity of CRGO, AuNR, and CRGO-AuNR nanocomposite with various concentrations in A549 cell; (B) in vitro phototoxicity of CRGO, AuNR, and CRGO-AuNR nanocomposite with various concentrations in A549 cell (880 nm, 1 W/cm2, 5 min).

    Tables

    The LSPR Peaks and Aspect Ratio of AuNRs according to the Amount of AgNO3
    Zeta Potential Measurement of Different Samples in Aqueous Solution

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