1. 서 론

최근 과학의 발전에 따라 질병과 건강을 지키기 위해 동식물을 이 용한 여러 항산화 물질들에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 호기 성 생명체의 산소는 생명유지를 위한 에너지 생산과정에 중요한 작용 을 하나 과산화수소(H₂O₂), hydroxyl radical (OH^-)과 같은 큰 활성산 소종(reactive oxygen species, ROS)을 유도하는 superoxide를 생성하 여 이에 독성에 노출되면 퇴행성질환 및 암 등 여러 질환의 직간접적 인 원인이 되고 있다[1]. 생체 내에는 ROS 활동을 막아주는 catalase, superoxide dismutase 등의 항산화 효소 및 페놀성 화합물과 플라보노 이드, 아스코르빈산, 토코페롤과 같은 물질은 활성산소종의 작용을 억 제한다고 알려져 있다[2]. 따라서 세포 내 활성산소를 제거하는 항산 화 기능을 증가시키는 천연물의 탐색과 연구가 활발하게 진행되고 있 다[3].

염증반응은 외부자극에 대한 생체의 정상적인 방어작용으로, 염증 이 발생하면 여러 가지 염증 매개 인자들이 생성되며 이로 인하여 조 직의 손상을 유발하여 결과적으로 관절염, 동맥경화 및 당뇨병 등의 여러 가지 질환의 원인이 된다[4]. 대식세포는 혈액 단핵세포로부터 분화된 조직 세포로 숙주의 항상성 유지와 같은 숙주 반응에 관여하 는 것으로 알려져 있으며, 염증반응이 일어나면 nitric oxide (NO), interlukin (IL)-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α)를 분비하여 생체 반응에 중요한 역할을 하는 세포로 알려져 있다[5]. NO는 염증반응의 지표물질로 L-arginine에서 NO synthase (NOS)에 의해 합성되며, 체 내 방어기능, 신호전달기능 등 다양한 생리 기능을 가진다. 그러나 lipopolysaccharide (LPS) 또는 염증성 cytokine 등에 의해 발현이 유도 되는 inducible NOS (iNOS)에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 심화 시켜 유전자 변이 및 신경 손상 등을 일으킨다[6].

간 질환은 과도한 스트레스, 흡연, 음주 및 약물 복용 등에 의해 높 은 발병률과 사망률이 지속적으로 나타나는 현대 생활의 주요한 질병 중 하나이며, 사회적 관심의 대상이 되고 있다[7]. 간은 생체의 주요 기관으로 소화 및 배설기능, 영양소 저장, 물질 합성 및 화학물질을 해독시키는 인체의 약물 대사 기관이다. 따라서 생체 내로 들어온 약 물과 같은 외부 물질이 간을 통과함으로써 영양소 외에도 독성 물질 에 노출될 위험이 비교적 높다[8]. 그 중 간 독성의 부작용으로 알려진 약품 중 하나로 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase) 저해제 로서 알츠하이머 증후군 치료제로 사용되고 있는 타크린(tacrine; 1,2, 3,4,-tetrahydro-9-aminoacridine hydrochloride)으로 이 약물을 복용하는 환자의 30~50%에 있어서 가역성 간 손상이 유발되므로 투약의 제한 을 비롯한 신중한 투약이 요구된다[9]. 타크린의 대사는 약물 또는 대 사체와 DNA 간 공유결합 또는 세포 내 단백질의 공유결합을 통하여 electophilic radicals, free radical을 형성하여 이온 농도 구배를 혼란시 키거나 ATP 생성을 저해하여 괴사(necrosis) 또는 세포자살(apoptosis) 을 유도시킨다[10].

송화분은 본초강목, 동의보감에서 맛이 달고 따뜻하며 영양 효과, 정장 작용, 거풍작용, 항염증 작용 및 지혈작용 등의 효과가 있는 것 으로 알려져 있다. 그리고 감기, 두통, 외상 출혈, 습진 및 피부염 등에 민간요법으로 사용되고 있으며, 송화다식, 송화주, 송화 국수 등 다양 한 방면에 활용되고 있다[11]. 화분에는 각종 아미노산, 비타민, 당질, 식물성 sterol류, 무기질뿐만 아니라 자연의 항생물질, 호르몬 등의 유 효물질이 다량 함유되어 건강에 크게 도움이 된다고 보고되어 있다 [12,13]. 하지만 송화분은 바람에 의해 매개되는 풍매화분으로 입자의 크기가 매우 작고 특이한 모양으로 세포벽이 보통의 일반적인 식물 세포벽과는 달리 물리적, 생화학적 분해 작용에 대하여 매우 안정화 되어있어 파쇄 및 분해시간이 오래 걸린다. 이러한 특성 때문에 송화 분의 단순 섭취 시 세포벽이 잘 분해되지 않아서 소화 흡수율이 매우 떨어지고, 세포벽 내부의 영양 성분들이 체내에 제대로 흡수되지 못 하며, 화분 외피의 immunoglubulin E (IgE)가 매개하는 과민 반응성 알레르기를 일으키는 단점이 보고되어 있다[14,15].

현재 시중에서는 송화분의 세포벽을 파쇄하기 위해 제트 밀링(Z-milling) 등의 물리적인 방법을 사용하여 제품화하는 관련 특허가 있으나, 파쇄시간이 30 h 이상 오래 걸려 생산성이 낮고, 생산 비용이 높은 단 점이 있다[16]. 또한, 파쇄 이후 송화분의 세포벽 내부 유용물질의 생 리 활성 기능이 용매에 따라 첨예하게 다른 양상을 보이기 때문에 기 능성 식품 소재에 알맞은 용매를 찾기 위한 실험 또한 진행하여야 한 다[17].

따라서 본 연구에서는 송화분을 probe sonicator (PS)를 이용하여 짧 은 시간 내에 초음파 파쇄하며 water, 70% ethanol, ethanol 등의 다양 한 용매로 추출하여 분획별 기능성을 확인하였다. 시료의 항산화 활 성을 검증하고, LPS로 염증을 유도한 RAW264.7 대식세포에서 염증 주요 매개물질인 NO 생성억제 효과와 cytokine을 측정하여 항염증 활 성을 확인하고자 한다. 또한, 간 보호 활성 탐색을 위해 HepG2 세포 를 이용하여 타크린으로 독성을 유발한 간세포 독성에 대한 보호 효과 를 탐색하였다.

2. 실 험

2.1. 실험 재료 및 시료의 추출

본 실험에 사용된 송화분(pine pollen)은 동광한방몰에서 파우더 형 태로 구매하였다. 송화분 추출물은 송화분의 10배에 해당하는 용매를 첨가하였고 각 용매에 30 min간 침지한 후 사용하였다. 각 추출물은 3,000 rpm에서 15 min 동안 원심분리하여 Whatman NO. 2 (Whatman, Lawrence, KS, USA) 여과지로 여과시킨 후 감압 농축(Rotary Evaporator N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)하여 동결건조기로 건조하 여 얻은 분말을 본 실험의 추출물로 사용하였다. 사용한 추출 용매로 는 물(water), 70% 에탄올(70% ethanol), 에탄올(ethanol)을 사용하였다. 이때 probe sonicator (sonic dismembrator model 500, fisher scientific, Japan)를 이용하여 450 W의 파쇄율로 10 min씩 3번 총 30 min간 처리 한 시료와 PS를 이용하지 않은 시료로 구분하여 실험의 추출물로 사용 하였다(Figure 1). 광학현미경(CM E Basic Microscope, Leica, Germany) 을 사용하여 파쇄유무를 확인하였다.

2.2. DPPH radical 소거 활성 측정

DPPH radical 소거능은 DPPH 자유 라디칼에 대한 환원력에 따른 흡광도의 변화를 측정할 수 있다. 추출물의 DPPH radical 소거능 측정 은 Blois[18]의 방법을 응용하여 측정하였다. 0.15 mM DPPH 용액 1.0 mL을 취하여 0.5 mL의 시료와 혼합하여 차광시킨 후 상온에서 30분 간 반응시키고 UV spectrophotometer (Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로 는 1.0 mL DPPH에 시료 대신 0.5 mL 증류수를 가한 용액을 사용하였 고 양성 대조군으로는 ascorbic acid를 사용하여 DPPH에 의한 radical 소거 활성을 계산하였다.

2.3. SOD 유사 활성 측정

SOD (superoxide dismutase) 유사 활성은 Marklund와 Marklund[19] 의 방법을 변형하여 시료 추출물 0.1 mL에 pH 8.5로 조정한 Tris-HCl buffer 용액 3.0 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 넣어 25 ℃에서 10 min간 반응시킨 후 1 N HCl 1.0 mL를 가하여 반응을 정지시켜 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 계산식에 해당하는 SOD like activity (%) = 100 - [(OD of sample / OD of control) × 100]에 의하여 활성을 산출하였다.

2.4. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

시료의 총 페놀 화합물 함량은 Folin-Denis[20] 방법을 변형하여 환 원 발색의 원리에 근거하여 흡광도 변화로 폴리페놀 농도를 측정하였 다. 추출물 0.5 mL에 1N Foin & Ciocalteu’s 시약 0.5 mL 혼합하여 3 min간 정치한 뒤 10% sodium carbonate 용액 0.5 mL를 넣고 혼합하 여 차광하고 1 h 동안 방치 후 흡광도 725 nm에서 측정하였으며, gallic acid를 표준물질로 이용하여 표준검량선을 작성하여 폴리페놀의 함량을 산출하였다. 총 플라보노이드 함량의 측정을 위해 Davis 변법 을 이용하여 측정하였다[21]. 시료를 0.1 mL과 diethylene glycol 1.0 mL 및 1N sodium hydroxide 용액 0.1 mL을 넣고 혼합을 한다. 그 후 37 ℃ water bath에서 1 h 동안 반응시킨 다음 흡광도 420 nm에서 측 정하였다. 표준물질은 naringin을 이용하였으며 표준곡선을 작성하고 이로부터 시료의 플라보노이드 함량을 결정하였다.

2.5. 송화분의 폴리페놀 화합물 HPLC 분석

송화분의 폴리페놀의 HPLC (Alliance e2695 Separations Module, Korea) 분석을 위해 각 시료를 10 mg/mL의 농도로 제조하여 0.22 μm PVDF filter로 여과한 다음 사용하였다. HPLC column은 C18 column (SunFire^TM 4.6 × 300 mm, 5 μm)을 25 ℃로 유지하여 사용하였고, 용 출속도는 0.8 mL/min로 용매는 A 용매(formic acid/H2O, 1 : 99, v/v) 및 B 용매(methanol)를 사용하여 B 용매를 기준으로 선형상 농도 구 배법(0~15 min 60%, 15~20 min 60%, 20~25 min 10%, 25~40 min 10%)으로 하여, UV 280 nm에서 시료는 20 μL injection 하였다.

2.6. 세포배양

본 실험에 사용된 대식 세포주인 RAW264.7 (KCLB, 40071)와 Human hepatocellular carcinoma인 HepG2 (KCLB, 88065) 세포는 한국 세포주 은행에서 분양받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum (FBS) 와 1% penicillin-streptomycin을 함유한 Dulbecco’s modified Eagles’s medium (DMEM)을 사용하여 37 ℃, 5% CO₂로 유지된 배양기에서 배양하였다.

2.7. 세포독성

시료 농도에 따른 세포독성을 확인하기 위해 RAW264.7 세포와 HepG2 세포의 MTT assay를 실시하였다. RAW264.7 세포를 6 × 10³ cells/well, HepG2 세포는 2.5 × 10⁵ cells/well의 농도로 96-well plate에 분주한 후 24 h 동안 배양하여 부착시켰다. 이후 각 시료 및 대조군을 농도별 (0, 62.5, 125.0, 250.0, 500.0, 1,000.0 μg/mL)로 처리한 후 24 h 동안 배양하였다. 5 mg/mL이 되도록 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ((MTT), Sigma, USA)를 PBS에 용해한 MTT 용액을 10% (v/v) 비율로 넣고 4 h 동안 반응 후 상등액을 제거한 뒤 dimethyl sulfoxide ((DMSO), sigma, USA) 0.2 mL을 넣고 30 min간 방 치하여 formazan을 용해시키고 microplate reader (Multiskan, Thermo Scientific, Korea)를 사용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 세포만 배양한 흡광도 값을 기준으로 비교하였다.

2.8. Nitric oxide 생성저해 효과

시료의 면역 증강능력을 확인하기 위해 NO assay를 시행하였다. RAW264.7 세포를 6-well plate에 2 × 10⁶ cells/well로 분주 후 24 h 동안 배양하여 부착시켰다. 100 μg/mL 농도로 시료 및 대조군을 처리 하고 1 h 후 LPS 1 μg/mL를 처리하여 24 h 동안 반응시켰다. 반응을 마친 상등액과 griess reagent (Sigma, USA)를 1 : 1로 섞어 15 min 동 안 실온에서 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포로부터 생성된 NO의 양은 NaNO₂ 표준액의 농도를 기준으로 계산하였다.

2.9. Cytokine 측정

시료가 LPS의 자극에 의해 생성되는 TNF-α와 IL-1β의 생성량에 미치는 효과를 측정하기 위해 NO 측정과 같은 방법으로 세포를 배양 한 후, 각 well에서 상등액을 회수하였다. ELISA kit (R&D System, Minneapolis, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음 흡광 도 450 nm에서 ELISA reader로 측정하였다.

2.10. 타크린 유발 독성에 대한 간세포 보호 활성 효능

각 세포의 타크린 유발 독성에 대한 간세포 보호 활성을 확인하기 위해 HpeG2 세포를 2.5 × 10⁵ cells/well의 농도로 96-well plate에 분 주한 후 24 h 동안 배양하여 부착시켰다. 이후 각 시료를 농도별 (100.0, 200.0, 500.0 μg/mL)로 처리한 후 24 h 동안 배양한 다음, 1.2 mM 타크린을 처리한 후 2 h 배양한 후, MTT assay룰 실시하였다. 이 때 양성대조 약물은 간 보호 기능이 밝혀진 silymarin (200 μg/mL)을 사용하였다.

2.11. 세포 배양액 내 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 활 성도 측정

간세포 손상 시 배양액으로 유리되어 나오는 GOT의 양을 측정함으 로써 간세포 손상 여부를 확인할 수 있다. GOT 활성도 측정을 위해 간세포를 free serum DMEM에 5 × 10⁵ cells/mL로 6 well에 3.0 mL씩 분주하여 24 h 예비 배양한 각 시료를 처리하여 37 ℃에서 5% CO₂, 95% O₂가 유지되는 CO₂ incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 그 후 타크린(1.2 mM)을 첨가하고 이를 다시 5 h 동안 배양한 다음 각각의 세포 배양액을 회수하여 1,200 rpm에서 2 min간 원심분리(Model SUPRA 21K, Hanil science Industrial, Co., Ltd, Korea)한 후 그 상등 액을 취하였다. 회수한 상등액은 아산제약에서 구입한 GOT assay kit (ASAN parm, Seoul, Korea)를 이용하여 GOT 활성을 측정하였다. GOT 측정용 기질액인 L-aspartic acid 및 α-ketoglutaric acid 1.0 mL을 37 ℃에서 5 min간 방치한 다음 배양액 0.2 mL과 잘 혼합하여 37 ℃에서 60 min간 방치한다. 정색시액인 2,4-dinitrophenyl hydrazine을 1.0 mL 첨가하여 실온에서 20 min 방치한 다음, 0.4 N NaOH 용액 10 mL과 잘 혼합하여 실온에서 10 min간 방치 후 505 nm에서 증류수를 대조 로 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 흡광도를 측정한다. 양성대 조 약물로는 silymarin을 사용하였다.

2.12. 세포 배양액 내 lactate dehydrogenase (LDH) 측정

LDH의 측정법의 원리는 pyruvic acid와 NADH₂가 LDH에 의해 lactic acid가 생성되고 NADH₂는 NAD로 될 때, 이 반응에서 소비된 NADH₂의 감속 속도를 측정하여 LDH를 340 nm에서 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 흡광도를 측정한다. 각 시료의 간세포 손상 에 대한 영향을 조사하기 위해 배지 내의 LDH 활성을 측정하였다. LDH 활성은 GOT 활성 측정과 동일한 방법으로 세포실험을 수행한 후 세포 배양액을 취한 다음 아산제약에서 구매한 LDH assay kit (ASAN parm, Seoul, Korea)를 이용하여 LDH 활성을 측정하였다. 양 성대조 약물로는 silymarin을 사용하였다.

2.13. 통계학적 검증

본 실험 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 차이를 검증하기 위해 SPSS 20 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 프로그램을 사 용하여 one-way ANOVA 분석 후 P < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple test를 실시하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. Probe sonicator (PS)를 이용한 송화분의 파쇄 유무 비교

일반 송화분과 PS를 이용하여 450 W의 파쇄율로 10 min씩 3번 총 30 min간 처리한 송화분의 파쇄 유무를 광학현미경으로 관찰하였다 (Figure 2). 일반 송화분은 Figure 2의 A에서는 송화분의 모양이 잘 유 지되고 있는 것을 확인할 수 있었고 PS를 이용한 송화분의 현미경 관 찰 모양은 B로 송화분의 모양이 파쇄된 것을 확인할 수 있었다. 이 결 과 PS를 이용하여 단시간 내의 송화분의 파쇄가 효율적으로 이뤄지는 것으로 판단된다.

3.2. DPPH radical 소거능 및 SOD 유사 활성 측정

추출 용매별 송화분 추출물들과 PS를 이용한 추출 용매별 송화분 추출물들의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거는 및 SOD 활성 측정 결과는 Table 1과 같다. DPPH radical 소거능의 경우 송화분의 모든 추출물에서 항산화 활성이 높게 나타났다. 그 중에서도 PS를 이용한 70% ethanol 추출물(70% ethanol-PS)에서 88.46 ± 1.79% 의 가장 높은 활성을 나타내었고 PS를 이용하지 않은 70% ethanol 추 출물과 비교하였을 때 1.16배 높아 유의적 차이가 나타났다. 이러한 결 과 송화분의 DPPH radical 소거능은 50% ethanol 추출물에서 가장 우 수하였다고 보고한 Kim 등[17]의 결과와 유사한 것으로 보인다.

SOD는 항산화 효소로서 생체 내에서 해로운 활성 산소를 과산화수 소로 전환시키는 반응 촉매 효소로[21] SOD 유사 활성 측정 결과 70% ethanol-PS, water-PS군에서 각각 95.26 ± 5.21, 89.90 ± 0.14%의 활성 이 높게 나타났다. PS를 이용하지 않은 추출물들의 결과와 비교하였 을 때 PS로 파쇄한 추출물들에서 유의적으로 높은 결과가 나타났다. 천연 항산화제인 L-ascorbic acid (99.37 ± 0.43%)와 비슷하게 나타나 PS를 이용한 송화분의 추출물이 항산화성 기능성 소재로도 사용이 가 능할 것으로 보인다.

3.3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

본 연구에서 분석한 송화분의 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 을 분석한 결과는 Table 2에 제시하였다. Gallic acid를 표준용액으로 하 여 검량선을 작성하고 gallic acid의 양으로 폴리페놀의 함량을 환산하 였다. 총 폴리페놀의 함량은 송화분 추출물에서는 water, 70% ethanol, ethanol 순으로 각각 158.81, 154.92, 141.99 mg of galic acid equivalents (GAE)/g의 폴리페놀이 측정되었다. PS를 이용한 송화분 추출물 에서는 water-PS와 etahnol-PS의 폴리페놀 함량은 160.06, 145.04 mg of GAE/g으로 PS를 이용하지 않은 송화분 추출물과 유의적 차이가 없었으나 70% ethanol-PS에서 277.69 mg of GAE/g의 폴리페놀 함량 으로 다른 실험군에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 이는 Kim 등[17] 의 연구의 송화분을 열수로 추출하였을 때 9.3 μg/mg의 총 폴리페놀 의 함량보다 월등히 높은 폴리페놀 함량을 나타내었다.

총 플라보노이드의 경우 ethanol 추출물에서 약 12.85 mg of NE/g, ethanol-PS 추출물에서 12.69 mg of NE/g 순으로 높게 나타났으며, PS 의 사용 유무와 상관없이 ethanol 추출물에서 플라보노이드의 함량이 높게 나타나는 것으로 판단된다.

3.4. 송화분의 폴리페놀 화합물 HPLC 분석

송화분 추출물 중 폴리페놀 함량이 높게 나타난 70% ethanol군의 폴레페놀 화합물을 HPLC로 분석하였다(Figure 3). 초음파 파쇄한 70% ethanol-PS군에서 파쇄하지 않은 군에 비해 전체적으로 약 1.48배 증 가하였고, 특히 gallic acid의 경우 두 군 모두 RT 6.2 min대에 나타났 으며 초음파 파쇄한 70% ethanol-PS군에서 파쇄하지 않은 70% ethanol군에 비해 약 1.68배 증가하여 앞선 폴리페놀 함량 측정 결과와 비 슷한 경향을 보였다. 따라서 초음파 파쇄를 이용하여 송화분을 추출 하였을 때 폴리페놀의 함량이 높게 나타나는 것으로 판단된다.

3.5. RAW264.7 cell viability

추출 용매별 송화분 추출물들과 PS를 이용한 추출 용매별 송화분 추출물들을 각각 0, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 RAW264.7 세포에 처리하여 24 h 배양한 후 분석한 결과는 Figure 4 와 같다. 송화분을 water, 70% ethanol, ethanol을 이용하여 추출한 추 출물에서 water 추출군을 제외하고 125 μg/mL의 농도까지는 80% 이 상이 생존율을 나타냈다(Figure 4(a)). 송화분을 PS를 이용하여 추출한 추출물들의 경우에는 모든 군에서 500 μg/mL의 농도까지는 80% 이 상의 생존율를 나타냈다(Figure 4(b)). 또한, 70% ethanol-PS 군과 ethanol-PS 군에서는 증식하는 효과도 있는 것으로 보였다. 따라서 모 든 시료가 세포에서 독성을 가지지 않는 것을 확인하였으며, 시료의 농 도는 독성을 나타내지 않는 100 μg/mL 이하의 농도로 결정하여 실험 을 수행하였다.

3.6. NO 생성량 측정

본 실험에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포에 용매별 송화분 추출 물의 NO 생성량을 측정한 결과는 Figure 5와 같다. LPS를 처리한 control에 비해 모든 군에서 유의적으로 NO 생성량이 감소하였다. 70% ethanol군에서 74.06 ± 3.28%의 NO 생성저해율을 보였다. PS를 이용한 모든 추출물에서는 control군보다 80% 이상의 저해율을 나타 냈다. 그중 70% ethanol-PS군에서 NO 저해율이 85.99 ± 0.12%로 가 장 높게 나타났다. 70% ethanol을 추출용매로 사용하였을 때 PS로 파 쇄한 군에서 PS를 사용하지 않은 군에 비해 유의적인 결과 차이가 나 타났다. Lee 등의 연구[22]에서도 송화분 추출물들의 NO 생성률이 용 량 의존적으로 감소함을 확인하여 NO 생성을 유의하게 억제함을 확 인하였다. 따라서 송화분 추출물들의 NO 생성억제 효능이 뛰어남을 확인할 수 있었고 PS를 이용하여 추출하였을 때 NO 생성억제율을 더 높여줌을 알 수 있었다.

3.7. Cytokine 생성억제 효과

본 실험은 시료가 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 생성되는 대 표적인 염증성 cytokine인 IL-1β와 TNF-α의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 ELISA 방법으로 측정하였다. IL-1β의 생성량은 normal군에서 62.25 pg/mL이었으나, LPS 자극군에서 1,715.67 pg/mL로 유의한 상승을 보였다. 송화분을 water, 70% ethanol, ethanol로 추출 한 시료가 각각 726.50, 902.67, 907.25 pg/mL로 나타났고, PS를 이용 한 송화분 추출물에서는 70% ethanol-PS, water-PS, ethanol-PS로 추출 한 시료가 각각 633.50, 801.05, 825.25 pg/mL의 농도로 control군에 비해 IL-1β 생성량이 낮았다. PS를 처리하지 않은 70% ethanol군은 control군과 비교하였을 때 47.39%로 나타났지만, 70% ethanol-PS군 은 63.08%로 가장 높은 IL-1β 저해율은 나타내어 PS 사용 유무에 따 른 유의적인 차이를 나타냈다(Figure 6(a)). TNF-α는 미토콘드리아에 서 ROS의 생성을 촉진함으로써 DNA 사슬의 절단과 세린 단백질분 해효소 활성을 유도하여 직접 종양세포를 죽이는 중요한 매개체 역할 을 한다[23]. 하지만 다량 분비되면 염증 및 면역반응에 관여하게 되 며, 혈관 확장 및 투과성 증가로 인한 혈장의 손상을 일으키게 된다. TNF-α의 결과에서 normal군에서는 270.44 pg/mL이었으나, LPS 자 극군에서 2,324.41 pg/mL로 유의한 상승을 보였으며, 70% ethanol-PS 군에서 LPS 자극군과 PS를 사용하지 않은 군보다 유의적으로 감소하 였다(Figure 6(b)). 70% ethanol-PS군은 1,802.78 pg/mL의 농도의 생성 량을 보였으며 이는 conrtol군에 비해 21.67%의 TNF-α 저해율을 나타 내었다. 이상의 연구결과를 살펴볼 때 PS를 이용한 송화분 70% ethanol 추출물에서 IL-1β와 TNF-α 생성억제 효과가 뛰어남을 알 수 있 었고 이는 염증 매개 cytokine을 억제하여 염증성 반응들을 차단함으 로 항염증 효과를 가짐으로써 향후 항염증 기능을 가지는 소재가 될 것으로 기대된다.

3.8. HepG2 cell viability

HepG2 세포에서 각 시료의 세포독성 여부를 알아보기 위해 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인하였다(Figure 7). HepG2 세초에 농도별로 시료를 처리하고 24 h 배양한 다음, MTT assay로 세포 생존 율을 측정한 결과 아무런 처치도 하지 않은 control의 세포 생존율을 100%로 봤을 때 송화분의 water, 70% ethanol, ethanol 추출물에서는 최고농도 1,000 μg/mL 첨가 시 95% 이상의 생존율을 보였다(Figure 7(a)). PS를 이용한 송화분 추출물들에서는 500 μg/mL 이하의 농도에 서 80% 이상의 생존율을 보였다(Figure 7(b)). 따라서 모든 시료가 HepG2 세포에 독성을 가지지 않는 것을 확인하였으며 시료의 농도를 500 μg/mL로 하여 각 실험을 수행하였다.

3.9. Cell viability를 통한 송화분 추출물 및 PS를 이용한 송화분 추출물들의 간 보호 활성

송화분 추출물과 PS를 이용한 송화분 추출물들을 100, 200, 500 μg/mL씩 농도별로 전처리한 다음, 타크린을 처리하여 간 보호 활성을 확인하였다(Figure 8). 아무런 처치를 하지 않은 control의 세포 생존율 을 100%로 보았을 때, 타크린만 처리한 negative control에서는 세포 생존율이 25.27 ± 1.57%로 현저하게 감소하였고 간 보호 효과가 알려 진 silymarin인 positive control (PC)의 세포 생존율은 59.53 ± 2.81% 이었다. 이때 모든 시료군들에서 농도 의존적으로 간 보호 활성을 나 타내는 것을 확인하였다. 그중 70% ethanol-PS군에서 500 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 36.85 ± 1.70%의 간 보호 효능을 나타내어 모 든 시료군에서 가장 높은 간 보호 효능을 나타내었다.

3.10. 혈청학적 지표에 의한 송화분 추출물 및 PS를 이용한 송화분 추출물들의 간 보호 효과

본 실험 결과에서 세포 생존율이 가장 높았던 500 μg/mL에서 송화 분 추출물과 PS를 이용한 송화분 추출물이 간세포에서 타크린에 의해 유도된 손상에 대한 보호 효과가 있는지 여부를 세포막 손상 시 배양 액 내로 유출되는 GOT와 LDH의 활성도를 측정하였다. GOT는 간세 포 안에 존재하며 간 손상에 의해 세포막이 파괴되면 세포 외로 유출 되어 수치가 상승하게 된다[24]. GOT 측정에서 타크린 손상을 준 결 과 negative control (NC)는 85.08 ± 0.45 Kamen/mL로 나타났고 양성 대조군인 silymarin을 사용한 positive control (PC)는 55.08 ± 0.61 Kamen/mL로 NC에 비해 약 35.26%의 저해효과를 나타냈다. Sample 군에서는 NC에 비해 70% ethanol-PS에서 약 28.36%의 가장 높은 저 해 효과를 나타냈으며, 다음으로 ethanol-PS에서 20.52%의 저해 효과 를 나타내어 PS를 사용한 송화분 추출물에서 PS를 사용하지 않은 추 출물보다 유의적으로 효과가 있는 것으로 나타났다(Figure 9(a)). LDH 는 간세포에 손상이 생기면 배지에 중에 유출되는 효소의 양이 증가하 게 되고 간세포 보호 작용이 있는 약물은 유리된 효소의 양을 감소시 킨다[25]. LDH에 대한 실험에서는 control군을 100%로 보았을 때, 타 크린만 처리한 NC군은 207.83%로 높게 나타났으며 PC군은 168.49% 로 NC에 비해 18.93%의 저해율을 나타냈다. 송화분 추출물 및 PS를 이용한 송화분 추출물에서 타크린 손상을 준 결과에 비해 약 2~13% 의 저해 효과를 보였고, PS를 이용한 송화분 추출물이 PS를 이용하지 안흥군에 비해 높은 저해 효과를 보여 유의적으로 차이가 나타냈다. 그중 70% ethanol-PS에서 약 13.47%의 저해 효과를 보였다. 이 결과 PC의 결과값보다는 높지 않지만, 70% ethanol-PS에서 유의적으로 GOT 와 LDH의 저해 효과를 나타내는 것을 확인하여 간 보호 효과를 확인 할 수 있었다(Figure 9(b)).

4. 결 론

송화분은 항염증, 지혈작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있으 나, 영양 성분들이 체내에 제대로 흡수되지 못하며 알레르기를 일으 키는 단점이 보고되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 본 연구에서 는 PS를 이용하여 짧은 시간 내에 송화분의 세포벽을 파쇄하여 용매 별로 추출하여 세포벽 내부 유용물질의 생리 활성 기능의 효과를 알 아보고자 하는 바이다. 광학현미경을 이용하여 송화분이 PS로 단시간 내에 파쇄가 효율적으로 이뤄지는 것을 확인하였다. PS를 이용한 송 화분 추출물의 경우 70% ethanol을 용매로 이용하였을 때 총 폴리페 놀이 함량이 277.69 mg of GAE/g으로 다른 군들에 비해 유의적으로 높게 나타났고, PS를 이용하지 않은 군에 비해 1.8배 높은 것으로 나타 났다. 항염증 실험의 경우 RAW264.7 세포에 독성이 없는 100 μg/mL 로 진행하였다. NO 저해율의 경우 70% ethanol-PS군에서 86%의 가 장 높은 저해율을 나타냈으며 PS를 사용하지 않은 군보다 1.2배 높은 저해율을 나타내었다. 또한 IL-1β, TNF-α의 경우 70% ethanol-PS군 에서 각각 control군에 비해 63, 22%의 저해율을 나타내었으며 PS를 사용하지 않은 군에 비해 각각 1.3, 3.8배 높은 저해율을 나타내었다. 마지막으로 간 보호 활성의 효과를 HepG2 세포로 독성이 나타나지 않는 500 μg/mL로 실험하여 확인하였다. GOT와 LDH의 경우 NC에 비해 70% ethanol-PS군에서 다른 군들에 비해 각각 약 28, 13%의 높 은 저해 효과를 나타내었고 PS를 사용하지 않은 70% ethanol군에 비 해 각각 31, 11%의 저해 효과를 나타내었다. 이 결과 PS를 이용하여 단시간 내에 세포벽의 파쇄가 효율적으로 이루어지며, 70% ethanol- PS군에서 PS를 사용하지 않은 70% ethanol군에 비해 항산화, 항 염증, 간 보호 효과가 뛰어난 것으로 확인하였으며, 송화분을 PS를 이 용하여 짧은 시간 내 파쇄하여 기능성 식품 소재로 사용 가능성이 있 을 것으로 판단된다.