1. 서 론
수질 오염발생에 있어서 오염 물질이 배출되는 형태에 따라 점원과 비점원으로 분류할 수 있다. 점원은 biochemical oxygen demand (BOD) 중심의 유기물질 오염을 포함한다. 반면, 비점원은 질소, 인과 같은 영 양염류, bacteria, virus 등의 미생물류, 중금속 등 여러 가지 오염물질 을 포함한다. 비점원으로 농업계에서는 가축분뇨, 비료, 농약, 농업배 수가 있다. 특히, 축산폐수는 발생량에 비해 오염 부하량이 매우 큰 고 농도 유기성 폐수로 질소, 인 등의 부영양화물질을 고농도로 함유하 고 있다. 대부분 가축의 성장촉진, 질병의 예방 등의 목적으로 가축사 료에 첨가되는 주입된 Cu와 Zn 같은 중금속이 분뇨로 배설된다. 중금 속은 낮은 농도에서도 수생 동⋅식물에게 독성을 일으키고, 생물분해 성 물질이 아니기 때문에 먹이 사슬에 축적되어 생태계 교란이 일어 날 수 있다[1]. 또한, free ammonia는 수생 생물에 독성을 일으키고, ammonium ion과 ammonia는 수중의 용존 산소를 감소시켜 수생식물 과 하천의 자정작용 등에 영향을 주고, 과량의 질소와 인은 부영양화 를 일으키는 주요 원인으로 알려져 있다[2,3].
축산폐수에 함유된 오염물질을 완전히 제거하기 위해서는 다른 처 리과정 보다도 더 많은 비용과 기술이 필요하다. 기존의 물리⋅화학적 처리 공정은 비용이 많이 들고 대량의 슬러지를 생산하며 2차 오염으 로 이어지고, 또 다른 추가적인 비용이 발생한다[4]. 최근 위와 같은 문 제점을 해결하기 위해 bacteria, fungi, algae, protozoa 등을 이용하여 폐수를 처리하는 생물학적 처리 공정에 관한 연구가 주목받고 있다. 일반적으로 미세조류는 농업용 배수로나 하천에서 쉽게 발견되고, 무 기 질소와 인을 성장에 이용하기 때문에 다양한 생물학적 처리 공정 중에서도 효율적으로 이용될 수 있다[5,6]. 또한, 미세조류는 중금속뿐 만 아니라 일부 유독성 유기화합물도 제거할 수 있으며, 2차 오염을 유발하지 않는다. 현재까지 미세조류 중 Chlamydomonas reinhardtii[7], Chlorella pyrenoidosa[8], Scenedesmus rubescens [9] 등은 폐수의 무 기 영양물을 제거하는 종으로써 다양한 방면으로 연구되고 있다. 폐 수의 오염물질을 제거하기 위해서는 적절한 종의 선택이 중요한데, Scenedesmus는 성장을 위해 유일한 질소원으로 nitrite 또는 ammonium 을 사용할 수 있는 중온성 단세포의 녹조류이다. 또한, Scenedesmus종 은 오염된 하천이나 연못에서 우점종으로 보고되어지고 있으며[10], 담수계에서 가장 일반적으로 분포하며 부 영양화된 수질을 정화하는 주요한 역할을 수행할 수 있어 폐수 처리에 효과가 있을 것으로 기대 된다[11,12]. 한편, 기존의 미세조류에 관한 연구는 주로 산업 및 도시 폐수에서의 영양염류 제거, CO2 고정화 및 바이오 오일 생산에 중점을 두고 있다. 하지만, 축산폐수 내 과다한 영양염류와 중금속 검출로 인 하여 수질오염의 발생이 증가함에도 불구하고 축산폐수의 처리에 관 한 연구는 초기단계로 실제적인 연구가 매우 미흡하며 많은 연구가 필 요한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 미세조류의 일종인 녹조류 Scenedesmus과에 속하는 Scenedesmus obliquus를 대상으로 최적 배양조건을 확립하기 위 해 온도, pH, 광주기에 따른 생장률을 측정하고, 영양염류(N, P) 및 중 금속(Cu, Zn)이 성장에 미치는 영향과 제거율을 확인하고자 하였다. 또 한, 연구 결과를 바탕으로 Scenedesmus obliquus를 실제 축산농가에서 배출되는 축산폐수에 적용시켜 축산폐수에 대한 Scenedesmus obliquus 현장 적용 가능성을 평가하였다.
2. 실 험
2.1. 실험 균주
본 연구에 사용된 미세조류는 녹조류 일종인 Scecedesmus obliquus 로 한국 생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)로부터 분양받았다. Scenedesmus obliquus의 전배양은 BG-11 medium을 사용하였다[13]. 전 배양된 미세조류를 10% (v/v)로 접종하여 온도는 28 ℃, pH 7을 유지 해주며, 광주기(light : dark cycle)는 14 : 10 h을 반복하는 조건으로 14일 간격으로 계대배양을 하였다. 광원 공급은 식물 재배용 주광색 형광램프(FL20SGP)를 사용하고, 광량은 150 mol/m2/sec 고정하였다.
2.2. 최적배양 조건 확립
Scecedesmus obliquus의 최적 배양 조건을 확립하기 위해 온도(15, 25, 28, 35 ℃), pH (3, 5, 7, 10), 광주기(10 : 14, 12 : 12, 14 : 10 h)의 조건하에 실험하였다. 250 mL cell culture flask에 배지 200 mL를 넣 고, 배양한 Scenedesmus obliquus를 0.5% (w/v)로 접종하여 14일 배양 하였다.
2.3. 영양염류(N, P)에 따른 성장과 제거율
질소와 인의 농도에 따른 Scecedesmus obliquus의 성장과 제거율을 확인하기 위해 배지 내 포함된 질소원(NaNO3)과 인원(K2HPO4⋅3H2O) 을 제외한 배지를 제조하였다. 실험을 위해 질소원과 인원으로 NaNO3, NH4Cl 및 K2HPO4를 이용하여 각각 500, 1,000, 5,000, 10,000 mg/L의 농도로 처리하였다. 처리구의 농도 설정 기준은 축산기술연구소에서 보고된 축종별 축산폐수 내 오염물질의 농도를 참고하여 질소와 인의 평균농도로 설정하였다. 처리구는 질소와 인을 농도별로 처리한 단일 및 혼합 처리구로 구성하였다.
2.4. 중금속(Cu, Zn)에 따른 성장과 제거율
실험에 사용된 중금속 표준용액은 일본의 KANTO CHEMICAL CO2 에서 시판되는 Cu standard solution (1,000 mg/L)과 Zn standard solution (1,000 mg/L)을 사용하였다. 처리구의 농도 설정 기준은 한국환경정책 평가연구원에서 보고된 가축분뇨의 중금속함량을 참고하여 10, 30, 50 mg/L의 농도로 설정하였다. 처리구는 Cu와 Zn을 농도별로 처리한 단일 및 혼합 처리구로 구성하였고, 혼합 처리구는 Cu와 Zn의 농도를 1 : 1 비율에 맞춰 진행하였다.
2.5. 미세조류 성장 측정
성장 측정은 수질 오염공정시험기준의 ES04312.1a chlorophyll-a 분석 법으로 측정하였다. 시료 10 mL를 유리 섬유여과지(GF/C, 45 mm)로 여과하고, 여과지를 넣은 조직 마쇄기에 아세톤과 증류수(9 + 1)를 넣 고 마쇄하였다. 마쇄한 시료는 원심분리관에 넣고 밀봉 후 4 ℃의 어두 운 곳에서 하루 동안 방치를 한 후 원심분리(500 g, 20 min)하여 상등액 을 따로 채취하여 부피 측정하였다. 분리된 상등액은 분광광도계 (Model UV Mini 1240 Shimadzu, Japan)를 이용하여 663, 645, 630, 750 nm 파장에서 Scenedesmus obliquus의 성장을 측정하였다.
2.6. 축산폐수에서의 현장 적용성 평가
축산폐수는 총 3곳의 농가에서 채취하였다. 축산폐수 A는 충북에 위치한 대규모 가축사육단지로부터 공급받았으며, B와 C는 소규모 축산 농가시설에 배출되는 방류수를 채취하였다. 3가지 축산폐수 모 두 축사시설에서 배출되는 수로로부터 10 m 떨어진 위치에서 채취하 여, 4 ℃ 저온실에서 보관하였다. 실험에 사용된 축산폐수는 부유물을 제거하고 침전시킨 후 필터링하여 사용하였고, 구성성분은 Table 1과 같다. 축산폐수에서의 T-N, T-P와 중금속(Cu, Zn)의 제거율 실험은 이 전 실험과 동일한 방법으로 수행하였다.
2.7. 수질분석
총 질소(total nitrogen, T-N)와 총 인(total phosphorus, T-P)의 측정은 수질 오염 공정시험기준법에 준하여 분석하였다. 총 질소 분석은 자외선 흡광광도법을 이용하여 분석을 실시하였으며, 총 인 분석은 아스코르 빈산에 의한 몰리브덴 청법을 이용하여 분석하였다. 중금속 분석을 위 해 수질 오염 공정시험기준법에 의한 질산-황산을 이용한 전처리 방법 을 사용하여 유도결합플라즈마 발광광도계(ICP-OES, Perkin Elmer)를 이 용하여 분석하였다. 사용된 중금속의 파장범위는 Cu2+ (327.393), Zn2+ (206.200)이며, 분석조건은 Table 2와 같다.
2.8. 통계분석
SAS package (statistical analysis system, version 9.1, SAS Institute Inc.)를 이용하여 실험 결과를 통계 분석하였다. 또한, 실험 결과의 유 의한 차이를 조사를 위해 ANOVA (analysis of variance) 분석과 Tukey’s HSD (honest significant difference) test를 실시하였고, 신뢰구간은 95% 수준으로 설정하였다. 모든 실험은 3반복으로 실시하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 배양조건(온도, pH, 광주기)에 따른 성장
온도조건에 따른 Scecedesmus obliquus의 성장을 측정하기 위하여 15, 25, 28, 35 ℃ 총 4가지로 조건으로 설정하였다. Scenedesmus obliquus 는 28 ℃일 때 가장 높은 생장률을 보였고, 15 ℃일 때 가장 낮은 생장 률을 보였다(Figure 1(A)). [15]의 연구결과에 따르면, Scenedesmus종 은 27 ℃의 온도일 때 가장 좋은 성장이 이루어졌고, [16]의 연구결과 에서는 302.7 K (29.55 ℃)에서 최대 생장률을 보였다고 하였으며, 본 연구결과가 두 연구결과와 유사하였다.
탄소원으로 이용되는 CO2의 용해도 및 가용성에 중요한 영향을 미 치는 pH는 3, 5, 7, 10으로 총 4가지의 pH 조건에서 성장을 측정하였 다. Scenedesmus obliquus는 중성인 pH 7일 때 가장 높은 생장률을 보 였고, pH가 높거나(pH 10) 낮을(pH 3) 경우 생장률이 저조하거나 성장 이 이루어지지 않았다(Figure 1(B)). 또한, Scenedesmus obliquus는 중 성인 pH 6에서 최대 생장률을 보였다는 [17]의 연구결과와 유사하였 다. [14]의 연구결과에 따르면, 다른 녹조류 종인 Chlorella vulgaris 또 한 pH 7~7.5 정도에서 가장 좋은 생장률을 보였다.
광주기(light : dark cycle) 조건에 따른 Scenedesmus obliquus의 성 장 측정은 10 : 14, 12 : 12, 14 : 10 h으로 총 3가지 조건에서 이루어 졌다. Light intensity가 강한 14 : 10 h일 때 가장 높은 생장률을 보였 고, light intensity가 약한 10 : 14 h일 때 가장 낮은 생장률을 보였다 (Figure 1(C)). 미세조류는 생산적인 광합성을 위해 적절한 광주기가 필 요하다. Adenosine triphosphate (ATP), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH)가 생산되는 광화학적 단계가 진행되기 위해 light가 요구되고, dark는 생화학적 단계에서 성장을 위해 필수적 인 분자를 합성하는데 요구된다[19]. 본 연구결과는 light intensity가 길어질수록 ATP와 NDAPH를 충분히 생성시킴으로써 미세조류의 성 장이 증가한다는 기존의 다른 연구결과에 부합하였다[20,21]. 따라서 배양조건에 따른 성장의 연구결과를 토대로 이후의 영양염류(N, P)와 중금속(Cu, Zn)에서의 성장 및 제거율 실험은 28 ℃, pH 7, 14 : 10 h의 조건하에서 실험을 진행하였다.
3.2. 영양염류(N, P)에 따른 성장과 제거율
Scecedesmus obliquus의 성장에 영향을 미치는 또 다른 요인인 영양 염류(N, P)에 의한 성장의 영향과 제거율을 확인하기 위해 질소와 인 의 단일 및 혼합 처리구는 각 500, 1,000, 5,000, 10,000 mg/L의 농도 로 설정하였다. 질소와 인의 각 단일 및 혼합 처리구 500 mg/L일 때 가장 높은 성장을 보였고, 농도가 증가할수록 성장이 저해되었다(Figure 2). 또한, 질소와 인의 단일처리구와 혼합처리구의 성장은 유사한 양 상을 보였다. 본 연구결과는 미세조류를 대량 배양하기 위해서 질소 농 도가 25~5,000 mg/L일 때 적합하고, 2~619 mg/L의 농도일 때 가장 높은 생산성을 보인다는 [22]의 연구결과와 유사하였다. 또한, 고농도 의 질소 처리구는 저농도 처리구와 비교하여 미세조류의 성장에 효과 적인 영향을 미치지 않고, 성장 저해를 초래한다는 [23]의 연구결과와 일치했다. [24]에 보고된 바와 같이 NH4+-N의 농도가 높을수록(> 500 mg/L) 미세조류 세포의 내부 NH4+ 농도가 증가했기 때문에 미세조류 성장에 유해한 효과를 나타냈다. 인은 일반적으로 미세조류 내 orthophosphate (PO42-) 등의 형태로 흡수되고, 정상적인 성장과 미세 조류 세포 발달에 필요한 중요한 성분으로 작용한다[25,26]. 본 연구 결과에서 다양한 농도의 영양염류가 초기 기간을 제외하고 연구 기간 동안 미세조류의 성장에 중요한 영향을 미쳤다.
질소는 14일간 농도별로 총 17.6~70% 제거율을 보였다(Table 3). 질소의 농도가 500 mg/L일 때 70%의 질소 제거율로 가장 높은 제거율 을 보였고, 10,000 mg/L에서 17.6%로 가장 저조한 제거율을 나타냈다. 인은 14일간 농도별로 총 8.4~34% 제거율을 보였다(Table 4). 인의 농 도가 500 mg/L일 때 34%로 가장 높은 제거율을 보였고, 10,000 mg/L 에서 8.4%로 가장 저조한 제거율을 나타냈다. 질소와 인의 혼합 농도 가 500 mg/L일 때 질소는 58%, 인은 40.3%로 가장 높은 제거율을 보 였고, 10,000 mg/L에서 질소는 12%, 인은 3%로 가장 저조한 제거율을 나타냈다(Table 5). 질소와 인의 단일 처리구 제거율과 유사한 양상을 보였지만 대체적으로 질소 단일 처리구의 제거율보다 저조했고, 인 단 일 처리구의 제거율 보다 높았다. 하지만, 공통적으로 질소와 인의 단 일 및 혼합처리구에서 제거된 영양염류의 양은 제거율이 낮을수록 증 가하였다. 이는 인공폐수 중에 있는 각 영양염류의 양이 Scecedesmus obliquus의 영양염류 제거 능력보다 더 많기 때문에 제거되고 남은 중 금속의 양이 증가하여 상대 값인 제거율이 낮아지는 것으로 판단된다 [27]. 또한, 공통적으로 농도가 증가할수록 생장률과 제거율이 저조하였 다. [28]의 연구결과에 따르면 미세조류의 성장은 배지 내 질소와 인 의 농도 비에 영향을 받으며, 고정된 인의 농도에서 배지 내 과량의 질 소를 제거할 수 있다고 하였다. 따라서 본 연구결과를 통해 Scecedesmus obliquus의 영양염류 제거는 생장률과 관련이 있다고 사료된다.
3.3. 중금속(Cu, Zn)에 따른 성장과 제거율
Scecedesmus obliquus는 Cu의 농도가 10 mg/L일 때 가장 높은 생장 률을 보였고, 농도가 증가함에 따라 생장률이 감소하였다(Figure 3(A)). Zn에서의 성장은 10 mg/L일 때 가장 높았지만, 시간이 경과함에 따라 서 성장은 농도별로 유의한 차이가 없었다(Figure 3(B)). Cu와 Zn 혼합 처리구의 성장은 30 mg/L일 때 가장 높았지만, 시간이 경과함에 따라 서 성장은 농도별로 유의한 차이가 없었다(Figure 3(C)). Scenedesmus obliquus의 성장은 중금속의 단일 및 혼합 처리구에서 유사한 양상을 보였고, 모든 처리구에서 시간이 경과함에 따라서 성장이 저해되었다. 또한, Scenedesmus obliquus의 성장에서 Cu보다 Zn의 저해효과가 강 한 것으로 나타났다.
Cu는 10, 30, 50 mg/L 농도별로 각 40.3%, 20.0%, 13.7%의 제거율을 보였다(Table 6). Zn은 10, 30, 50 mg/L 농도별로 각 30.0, 10.0, 10.0% 의 제거율을 보였다(Table 7). Cu와 Zn의 혼합 처리구 10 mg/L에서 Cu 40.0%, Zn 20.0%가 제거되었고, 30 mg/L에서 Cu 23.3%, Zn 13.3%가 제거되었고, 50 mg/L에서 Cu 16.0%, Zn 12.0%가 제거되었다(Table 8). Scenedesmus obliquus는 단일 및 혼합 중금속 처리 시 Zn에 비해 Cu를 더 효과적으로 제거하는 것으로 나타났다. 미세조류는 세포벽 표면의 다당류, 단백질 또는 지질로 인해 높은 금속 이온을 bioaccumulation 및 biosorption 할 수 있다[29]. Biosorption은 죽은 유기체를 사용하여 세포 벽 또는 고분자물질에 중금속이 부착되어 제거되는 형태로 대사 비의 존형이며, bioaccumulation의 첫 단계이다[30]. Bioaccumulation은 대사 의존형으로 전자전달계, 효소, 에너지 소비 등을 이용하여 세포막을 거 쳐 세포 내로 중금속이 축적되며 살아있는 유기체에서만 발생된다[31]. 따라서 본 연구에서는 인공폐수 내 중금속이 살아있는 Scenedesmus obliquus의 세포 내로 축적되어 중금속 농도가 감소된 것으로 사료된 다. 반면, 공통적으로 제거율이 낮을수록 제거된 중금속의 양은 증가 하였는데, 인공폐수 중 중금속이 Scecedesmus obliquus의 제거 능력을 초과할 정도로 존재하기 때문으로 판단된다. 중금속의 낮은 제거율을 개선하기 위하여 추가적으로 최대 제거 효율을 나타낼 수 있는 주입 량에 대한 kinetic model을 제작하여 적정 주입량을 설정하여 보완해 야 할 것으로 사료된다.
3.4. 실제 축산폐수 적용 가능성 평가
이전 인공폐수에서의 연구결과를 바탕으로 Scecedesmus obliquus의 실제 축산폐수에 대한 적용가능성을 평가하였다. 축산폐수 A, B, C에 서 모두 약 8일 동안의 lag phase를 거쳐 그 이후에는 log phase로 생장 률이 증가한 것을 볼 수 있었다(Figure 4). 또한, 배지와 인공폐수 성상 에서 보다도 높은 생장률을 보여 현장적용성에 적합함을 보여주었다.
Table 9는 축산폐수 3곳에 대한 중금속(Cu, Zn)과 영양염류(N, P)의 제거율을 나타낸 결과이다. 인공폐수와는 달리 고농도의 실제 축산폐 수에서 미세조류는 부유물에 의해 빛의 전달이 방해를 받고, 유기물이 나 암모니아성 질소의 농도가 높을 경우 성장이 저해된다[18]. 그렇기 때문에, 본 연구결과에서 Scenedesmus obliquus의 성장은 인공폐수보 다 축산폐수에서 긴 lag phase를 가지며 느린 성장속도를 보였다. 하지 만, 이후 긴 log phase로 활발하게 성장이 이루어졌다. 또한, Scenedesmus obliquus의 축산폐수 내 영양염류 및 중금속 제거율은 인공폐수와 유 사한 경향을 보였다. 따라서, Scenedesmus obliquus를 이용한 축산폐 수 처리에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다. 하지만, 실제 폐수에서 제거된 오염물질의 양은 총 질소 약 921~1,382 mg/L, 총 인 약 30~60 mg/L, Cu 약 5~7 mg/L, Zn 약 6~7 mg/L가 제거되었다. 제거율이 높아도 제거된 양은 낮았으며, 인공폐수의 제거효율보다 더 낮게 나타났다. 실제 현장 폐수에서는 인공폐수와는 다른 다양한 환 경조건들로 인해 Scenedesmus obliquus의 활성에 많은 영향을 미쳤기 때문이라고 사료된다. 이에 따라, 미세조류가 결합된 생물 담체를 제 조하거나, 미세조류와 공생관계를 가진 생물을 결합하여 co-culture를 하는 등의 추가 연구를 통해 제거 효율을 높일 수 있을 것으로 예상된 다. 생물 담체의 경우 비교적 단시간 내 흡착반응이 진행되기 때문에 다량의 오염물질을 신속하게 제거할 수 있으며[32], 반응이 상온에서 이루어지므로 환경조건에 의해 영향을 받는 부분들이 많이 줄어들 수 있다. 또한, co-culture 기술은 autotrophic 미세조류와 heterotrophic 생 물체를 결합하여 서로 성장에 필요한 산소와 이산화탄소를 공급함으 로써 공생관계를 유지하여 자립적인 성장환경을 만든다. 하지만, 대안 으로 제시한 연구들은 Scenedesmus obliquus를 적용시킨 연구의 사례가 드물며, 추가적인 연구를 통해 제거효율의 향상 가능성을 파악해야 할 것으로 사료된다.
4. 결 론
본 연구의 결과를 통해 Scenedesmus obliquus의 최적 배양조건은 온 도 28 ℃, pH 7, 광주기(light : dark cycle) 14 : 10 h의 조건으로 확립 하였다. 영양염류의 단일 및 복합 처리구(각 500, 1,000, 5,000, 10,000 mg/L)와 중금속(Cu, Zn)의 단일 및 혼합 처리구(10, 30, 50 mg/L)에서 농도가 감소할수록 생장율과 제거율이 높았다. 또한, Scenedesmus obliquus 중금속 처리 효율은 Zn에 비하여 Cu가 높은 것으로 나타났다. 실제 축산폐수에 Scenedesmus obliquus를 적용시켰을 때 축산농가 샘 플(A, B, C)의 생장률, 영양염류(N, P)와 중금속(Cu, Zn)의 처리효율 은 인공폐수와 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서 본 연구의 결과를 통해 Scenedesmus obliquus는 축산폐수 내 존재하는 영양염류(N, P) 및 중금속(Cu, Zn)의 거동특성을 파악하여, 폐수 처리에 적용할 수 있 다는 것을 확인하였다. 또한, 본 연구결과에서 오염물질의 낮은 제거 효율을 미세조류를 결합한 생물 담체와 공생관계를 통한 co-culture의 추가 실험을 통해 향상시킬 필요가 있을 것으로 사료된다.