1 서 론

플라보노이드성분(total flavonoids)은 phenylalanine으로부터 합성되 는 식물색소이며, 채소나 과일에서 흔히 보이는 벤조 Y 피론 구조를 특징으로 하는 폴리페놀 화합물의 큰 무리를 구성한다. 또한 플라보 노이드는 radical scavengers로서의 높은 약리활성 때문에 인체의 건강 에도 매우 중요하다[1-2]. 폴리페놀성분이 풍부한 과일이나 채소를 많 이 섭취할수록 각종 질환 및 암 발생률을 줄일 수 있다는 연구결과가 발표되었으며, 최근에 과일이나 채소에 함유된 플라보노이드성분의 건강증진기능(health promoting functions)에 대한 연구가 활발히 진행 되고 있다[3-8]. 이러한 플라보노이드성분은 은행잎, 녹차잎, 칡뿌리, 밀싹 등 주로 식물 중에 함유되어 있다. 이 중 밀싹(wheat sprout)은 전 세계적으로 재배되는 작물로 농작이 쉬우며 풍부한 영양분을 포함 하고 있다는 장점을 가지고 있어 차세대 대표 영양식물로 손꼽히고 있다. 또한 성장이 끝난 밀보다 성장이 끝나지 않은 밀싹에서 더 높은 플라보노이드 성분과 영양소를 함유하고 있어, 싹을 이용한 추출 최 적화 연구가 활발히 진행되고 있다[9-10].

천연물로부터 유효성분을 추출하는 추출공정의 최적화를 위해 반 응표면분석법(response surface methodology, RSM) 중 중심합성계획 모델(central composite design model, CCD model)을 이용하였다. 중 심합성계획모델은 실험을 바탕으로 경향성을 분석해 회귀방정식을 유도하고 목표값에 최적화 시키는 분석방법이다. 이는 상호 작용을 독립 변수의 효과 정의뿐만 아니라 변수 사이의 주효과도를 최적화할 수 있다[11-13]. 따라서 본 연구에서는 천연물로 밀싹을 이용하여 플 라보노이드성분을 추출하고 중심합성계획모델을 이용하여 추출공정 을 최적화하고자 하였다. 중심합성계획모델의 반응치(response)로는 추출수율과 플라보노이드성분 함량을 설정하고, 독립변수인 추출시 간, 주정/초순수 부피비, 추출온도에 따른 주효과도와 교호효과도를 해석하였다. 이를 바탕으로 중심합성계획모델로부터 산출된 회귀방정 식을 이용하여 추출수율과 플라보노이드성분 함량을 동시에 최적화 시킴으로써 최적 추출조건을 제시하고자 하였다.

2 실험방법

2.1 밀싹으로부터 플라보노이드성분의 추출

실험에 사용된 밀싹은 푸드믹서로 분쇄하여 건조한 후 추출용매 500 mL를 기준으로 준비된 20.0 g의 시료를 이용하여 추출공정을 수 행하였다. 추출용매로는 초순수와 95%-주정(대한주정라이프, 95%)을 이용하였으며, 추출공정의 최적화 과정에서 반응표면분석법의 독립변 수로는 추출시간(1~4 h), 주정/초순수 부피비(20~80 vol%), 추출온도 (40~70 ℃) 등을 설정하였다. 기초실험으로부터 각 독립변수의 최적 추출 범위를 결정한 후 반응표면분석법 중 중심합성계획모델을 이용 하여 최적화 과정을 수행하였다. 이때 반응치로는 추출된 유효성분의 수율과 플라보노이드 함량(total flavonoids)을 선정하였다. 추출된 유 효성분의 수율은 냉동건조법(freeze drying method)을 이용하여 측정 하였다. 밀싹으로부터 추출된 유효성분은 여과과정 거친 후 진공증류 를 통해 농축하여 -10 ℃로 6 h 동안 1차 동결한다. 동결된 시료는 냉 동건조장치(LP3, Jouan, France)에서 0.1 mbar, -40 ℃의 조건으로 24 h 건조하여 수율을 측정하였다.

2.2 플라보노이드성분의 분석

밀싹으로부터 추출된 유효성분의 플라보노이드성분 분석은 자외선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 플라보노이드성분의 검정곡선을 작성하기 위해 표준물질로 quercetin (Sigma-Aldrich, Q4951)을 이용 하였으며, 자외선 파장은 415 nm에서 측정하였다[2].

냉동 건조한 시료 1 mL (1 mg/mL)에 질산알루미늄(aluminum nitrate) 과 아세트산 칼륨(potassium acetate)을 혼합하여 분석시료를 제 조하고 암실에서 40 min간 방치한 후 자외선 분광광도계를 이용하여 정량하였다. 측정된 흡광도는 검정곡선을 이용하여 quercetin equivalents (μg QE/mL dw)로 환산하였다[14-15].

3 결과 및 고찰

3.1 반응표면분석법의 독립변수 설정

밀싹으로부터 플라보노이드성분을 추출하기 위한 추출공정의 독립 변수를 설정하기 위해 본 연구에서는 기초실험을 진행하였다. 추출공 정의 독립변수로는 추출시간(1~4 h), 주정/초순수 부피비(20~80 vol%), 추출온도 (40~70 ℃) 등을 선택하였으며, 넓은 범위의 실험변 수로부터 밀싹 중 유효성분의 추출수율과 플라보노이드성분 분석을 통해 반응표면분석법에 적용할 독립변수범위를 설정하였다.

Figure 1은 독립변수에 따른 유효성분의 추출수율과 플라보노이드 성분 함량을 나타낸 그림이다. 추출시간이 증가함에 따라 유효성분의 추출수율은 증가하는 경향을 나타내었으나 3 h 이상에서는 추출량의 변화가 거의 나타나지 않았다. 또한 플라보노이드성분은 추출시간이 증가하면 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 추출과정 중 추출시간이 증가함에 따라 추출량은 증가하나 추출물 중 플라보노이 드성분 함량은 거의 일정하게 추출됨으로써 추출수율은 증가하나 추 출물 중 플라보노이드성분 함량은 감소하기 때문으로 사료된다. 주정/ 초순수 부피비에 따른 밀싹 중 유효성분의 추출수율과 플라보노이드 성분 함량을 측정한 결과 주정의 농도가 증가함에 따라 추출수율과 플라보노이드성분 함량 모두 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다. 추출온도 변화에 따른 추출수율과 플라보노이드성분 함량의 변화 역 시 추출시간과 마찬가지로 추출수율은 추출온도가 증가함에 따라 증 가하는 경향을 나타내었으나 플라보노이드성분 함량은 증가하다 감 소하는 경향을 나타내었다. 이는 추출온도가 증가하면 추출량은 증가 하나 밀싹 중 추출되는 플라보노이드성분 함량은 거의 일정하게 추출 되기 때문으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 추출수율과 플라보노 이드성분 함량을 모두 고려하여 반응표면분석법에 적용할 독립변수 의 범위를 추출시간(2.0~3.0 h), 주정/초순수의 부피비(40~60 vol%), 추출온도(50~60 ℃)로 좁게 설정한 후 반응표면분석법의 최적화과정 을 진행하였다.

3.2 반응표면분석법을 이용한 추출수율 최적화

본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 밀싹의 추출공정의 추 출조건을 최적화하였다. 반응표면 분석법은 통계학적인 특성과 수학 적 기술을 결합하여 여러 조건에 따른 최적화된 공정을 제시한다[16]. 추출공정에 중요한 독립변수로 고려되는 인자에 대한 실험범위는 추 출시간(2.0~3.0 h), 주정/초순수의 부피비(40~60 vol%), 추출온도 (50~60 ℃)를 사용하였다. 독립변수에 영향을 받는 반응치는 유효성 분의 추출수율과 플라보노이드성분 함량을 측정하여 그 값을 회귀분 석에 사용하였다. 중심합성계획법에 따라 설계된 추출공정의 추출수 율에 대한 반응표면분석 회귀방정식은 다음과 같다.

여기서 Y 는 반응표면분석법에서 반응치로 설정한 유효성분의 추출 수율이고, 독립변수인 x₁, x₂, x₃ 는 각각 추출시간, 주정/초순수의 부 피비, 추출온도이다.

Figure 2는 반응표면분석법을 이용하여 얻은 회귀방정식을 이용하 여 추출수율에 독립인자의 영향을 3차원 그래프와 등고선도로 나타내 었다. 일정한 추출온도에서 추출시간과 주정/초순수의 부피비가 증가 함에 따라 밀싹으로부터 추출된 유효성분의 추출수율은 증가하다 감 소하는 경향을 나타내었으며, 일정한 주정/초순수의 부피비에서 추출 시간과 추출온도에 대한 추출수율의 경향 역시 같은 경향성을 나타내 었다. 또한 일정한 추출시간에서 주정/초순수의 부피비와 추출온도에 대한 추출수율의 경향성도 증가하다 감소하였다. 이로부터 본 연구에 서 설정한 반응표면분석법의 독립변수범위의 중간영역에서 가장 높 은 추출수율을 나타내었다.

반응표면분석법으로부터 산출된 회귀방정식을 통해 추출공정 독립 변수의 주효과도, 교호효과도, 적합성 결여 등을 판단할 수 있다. 본 연구의 주효과도인 추출시간, 주정/초순수의 부피비, 반응온도가 반응 치인 추출수율에 영향을 끼치는 정도를 수치화 하면 추출시간 : 주정/ 초순수의 부피비 : 추출온도 = 19.17 : 1.0 : 3.98의 비율로 나타났다. 또한 교호효과도인 (추출시간 × 주정/초순수의 부피비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출온도)의 비율은 2.46 : 10.11 : 1.0로 나타났다. 독립변수의 주효과도를 확인하기 위해 각 독립변수 의 증감에 따른 추출수율의 변화를 Figure 3에 나타내었다. Figure 3은 본 연구에서 산출된 최적조건인 추출시간(2.44 h), 주정/초순수의 부 피비(50.0 vol%), 추출온도(54.41 ℃)를 기준으로 기초실험으로부터 선정된 각 독립변수 범위의 10%를 증가 또는 감소시켜 회귀방정식으 로부터 계산하였다. 추출시간의 경우 최적추출시간 2.44 h을 기준으 로 ± 0.1 h, 주정/초순수의 부피비의 경우에는 최적조건인 50.0 vol% 을 기준으로 ± 2.0 vol%, 추출온도의 경우 최적추출온도인 54.41 ℃를 기준으로 ± 1.0 ℃로 설정하였다. 모든 독립변수의 경우 추출수율에 대한 최적조건을 기준으로 증가하다 감소하는 경향을 나타내었으며, 추출시간과 추출온도가 주정/초순수의 부피비에 비해 상대적으로 큰 영향을 미치는 독립변수인 것을 알 수 있었다.

3.3 반응표면분석법을 이용한 플라보노이드성분 함량 최적화

반응표면분석법 중 중심합성계획법에 따라 설계된 추출공정의 플라 보노이드성분 함량에 대한 반응표면분석 회귀방정식은 다음과 같다.

Figure 4는 회귀방정식을 이용하여 계산된 독립인자에 따른 추출된 유효성분의 플라보노이드성분 함량을 3차원 그래프와 등고선도로 나 타낸 그림이다. 일정한 추출온도에서 추출시간과 주정/초순수의 부피 비가 증가함에 따라 밀싹으로부터 추출된 유효성분의 플라보노이드 성분 함량은 증가하다 감소하는 경향을 나타내었으며, 일정한 주정/초 순수의 부피비에서 추출시간과 추출온도에 대한 플라보노이드성분 함량의 경향 역시 같은 경향성을 나타내었다. 또한 일정한 추출시간 에서 주정/초순수의 부피비와 추출온도에 대한 플라보노이드성분 함 량의 경향성도 증가하다 감소하였다. 또한 회귀방정식으로부터 독립 변수가 반응치인 플라보노이드성분 함량에 미치는 영향을 수치화하 면 추출시간 : 주정/초순수의 부피비 : 추출온도 = 27.17 : 1.0 : 5.50의 비율로 나타났다. 또한 교호효과도인 (추출시간 × 주정/초순수의 부피 비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출온도)의 비율은 1.75 : 1.25 : 1.0로 나타났다. 독립변수에 따른 플라보노이드성 분 함량에 대한 주효과도를 확인하기 위해 각 독립변수의 증감에 따 른 추출수율의 변화를 Figure 5에 나타내었다. 추출시간과 주정/초순 수의 부피비의 경우 최적조건을 기준으로 증가하는 경향을 나타내었 으나 최적조건 이후 증가율이 감소하였다. 또한 추출온도의 경우 최 적조건을 기준으로 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 밀 싹으로부터 플라보노이드성분을 추출하는 추출공정의 경우 변화폭이 가장 큰 추출시간이 가장 중요한 독립변수인 것을 알 수 있었다.

3.4 종합만족도 평가

본 실험에서의 유효성분의 추출수율 및 플라보노이드성분 함량을 각각 중심합성계획모델을 통해 최적화를 시킨 결과 추출수율의 경우 추출시간(2.44 h), 주정/초순수의 부피비(49.75 vol%), 추출온도(54.41 ℃)에서 개별 최댓값(30.14 wt%)을 가지고, 플라보노이드성분 함량의 경우에는 추출시간(2.54 h), 주정/초순수의 부피비(51.78 vol%), 추출 온도(54.88 ℃)에서 개별 최댓값(35.68 μg QE/mL dw)을 나타내었다. 두 반응치를 모두 고려할 경우 최적조건은 추출시간(2.44 h), 주정/초 순수의 부피비(50.00 vol%), 추출온도(54.41 ℃)로 산출되며 이때 추 출수율은 30.14 wt%, 플라보노이드성분 함량은 35.59 μg QE/mL dw 을 얻을 수 있었다. 이 값들은 더 높은 정확성과 개별적으로 더 큰 값 을 갖는 개별분석과의 차이가 매우 작기 때문에, 종합분석에 있어서 적합한 결과를 얻을 수 있는 실험이라고 판단할 수 있다. 이는 두 반 응치가 서로 연관성이 있고, 뚜렷한 경향성을 보이는 것으로 분석할 수 있다. 이는 개별 또는 종합분석의 종합만족도가 모두 100%라는 점 을 근거로 뒷받침할 수 있다. 따라서 중심합성계획모델의 종합 최적 화 예상값의 변수조건인 추출시간(2.44 h), 주정/초순수의 부피비 (50.00 vol%), 추출온도(54.41 ℃)를 바탕으로 실험을 진행해보았을 때, 유효성분 추출수율(29.92 wt%), 플라보노이드성분 함량(35.32 μg QE/mL dw)의 실험값을 얻을 수 있었으며, 이를 예상 이론치와 비교 했을 때 오차율은 각각 0.39, 0.74%이다. 이는 두 개의 반응치를 동시 에 분석하는 다중분석 종합분석임에도 불구하고 정확도가 충분히 합 당했으며, 이는 반응표면분석법에 대한 추출분야의 적용도 합당하다 고 판단할 수 있는 결과임을 확인할 수 있었다.

4 결 론

플라보노이드성분 함량이 높은 밀싹을 이용하여 유효성분을 추출 하고, 중심합성계획모델을 이용하여 추출공정을 최적화한 결과 다음 과 같은 결론을 얻을 수 있었다.