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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)
Applied Chemistry for Engineering Vol.35 No.6 pp.530-538
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2024.1068

Reactive Oxygen Species-degradable Hydrogel System for Effective Localized Photodynamic Therapy of Cancer

Ji In Lee*, Jongseon Choi*, So Yeon Kim*,**†
*Graduate School of Energy Science and Technology, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
**Department of Chemical Engineering Education, College of Education, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
† Corresponding Author: Chungnam National University Department of Chemical Engineering Education, College of Education, Daejeon 34134, Korea Tel: +82-42-821-5892 e-mail: kimsy@cnu.ac.kr
October 2, 2024 ; October 7, 2024 ; October 25, 2024

Abstract


Recently, photodynamic therapy (PDT), one of the phototherapy methods, requires various therapeutic strategies to overcome the limitations of photosensitizer (PS) with hydrophobicity and non-selectivity. In this study, we designed a reactive oxygen species (ROS)-degradable hydrogel (PNIPAM-C/PS) based on a thermo-sensitive polymer (poly(N-isopropylacrylamide)) containing PS for effective localized PDT of cancer. We successfully synthesized a crosslinker with a thioketal bond degradable by ROS, and a thermo-sensitive injectable hydrogel was fabricated using the ROS-responsive crosslinker. PNIPAM-based injectable hydrogel was able to be injected through syringe needles at room temperature, but it was converted to gel phase through phase transition at 37 °C above LCST. PNIPAM-C/PS injectable hydrogel prepared using ROS-degradable crosslinker was selectively degraded in ROS environments and showed good biocompatibility before and after degradation. When irradiated with a 670 nm laser, PNIPAM-C/PS injectable hydrogel showed high phototoxicity by ROS generation. The PNIPAM-C/PS injectable hydrogel with selective degradation properties and excellent phototoxicity by ROS could be promising materials for effective localized PDT of cancer.


Injectable hydrogel , Thioketal , Poly(N-isopropylacrylamide) , Reactive oxygen species , Photodynamic therapy

효과적인 종양 국소 부위 광역학 치료를 위한 활성 산소 분해성 하이드로겔

이지인*, 최종선*, 김소연*,**†
*충남대학교 에너지과학기술대학원
**충남대학교 사범대학 화학공학교육과

초록


광 치료 요법 중 하나인 광역학 치료(photodynamic therapy)는 소수성 및 낮은 선택성을 갖는 광증감제의 한계를 극복하기 위한 다양한 치료 전략이 요구되고 있다. 본 연구에서는 효과적인 종양 국소 부위의 광역학 치료를 위해 광증감 제가 담지된 온도 감응성 고분자 poly(N-isopropylacrylamide) 기반의 주입형 하이드로겔(injectable hydrogel) (PNIPAMC/ PS)을 개발하였다. 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 분해성을 갖는 티오케탈 결합을 포함한 가교제를 성공적으로 합성하였고, 이를 사용하여 제조된 하이드로겔은 실온에서 주사기를 통해 주입이 가능한 반면 37 °C 이상의 온도에서는 상전이를 통해 gel phase로 전환될 수 있었다. PNIPAM-C/PS 주입형 하이드로겔은 ROS 환경에서 선택적 분해성 및 분해 전/후 높은 생체 안전성을 보였다. 또한, 670 nm 파장의 광원을 조사하였을 때, 생성된 ROS에 의해 높은 세포 독성을 나타내었다. ROS에 의한 선택적 분해성 및 우수한 광독성을 갖는 PNIPAM-C/PS 주입형 하이드로겔은 효과적인 종양 국소 부위의 광역학 치료 분야에 다양하게 응용 가능할 것이라 여겨진다.


    1. 서 론

    최근 암에 의한 사망률이 지속적으로 증가함에 따라 효과적인 암 치료 방법에 대한 필요성이 전 세계적으로 높아지고 있다[1]. 암은 인간의 사망 원인 중 가장 높은 비중을 차지하고 있으며, 2020년에는 약 1,000만 명이 사망하고 2030년에는 약 1,310만 명이 사망할 것으로 예상된다[2,3]. 기존의 화학요법(chemotherapy)은 낮은 선택성, 제한적인 치료 효과, 강한 독성 부작용 그리고 환자에게 고통을 주는 치료 과정 등 여러 단점들이 있어 임상 적용과 치료 성과에 한계를 보인다 [4,5]. 최근 다양한 치료 전략과 표적 치료(targeted therapy)의 발전에도 불구하고 화학 요법에 의한 환자의 생존율은 크게 개선되지 않았다. 따라서, 낮은 부작용, 높은 선택성, 그리고 향상된 암 치료 효과를 위한 새로운 치료 전략이 요구되고 있다.

    빛에 의해 활성화되는 광 치료제 기반 광 치료(phototherapy)는 다양한 악성 종양을 치료하는 유망한 치료법 중 하나이다[6,7]. 광역학 치료(photodynamic therapy)는 광증감제(photosensitizer)를 체내에 주입한 후에 특정 파장의 빛을 조사하여 발생한 과량의 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 암세포를 파괴하는 광 치료 요법이다[8, 9]. 기존의 암 치료 방법과 다르게 광역학 치료는 정상세포에 손상을 최소화하며 효과적, 선택적으로 암세포를 파괴할 수 있는 장점을 가지고 있다. 비침습적 치료법인 광역학 치료는 암 치료에서 뛰어난 성과를 보이지만, 제한된 광 침투 깊이, 낮은 종양 선택성, 산소 의존성을 포함한 피할 수 없는 단점이 있어 종양 치료에 대한 치료 효율이 크게 제한된다. 다양한 종류의 광증감제가 개발되었지만, Food and Drug Administration (FDA)의 승인을 받은 물질은 소수에 불과하다[10]. 또한, 상용화된 대부분의 광증감제는 낮은 수용성과 내재화(cellular internalization) 및 낮은 종양 표적 능력으로 인해 치료 효율이 감소하기 때문에 이에 대한 개선이 시급한 상황이다[11,12].

    하이드로겔(hydrogel)은 친수성 고분자가 물리적 또는 화학적 결합에 의해 가교되어 만들어진 3차원 망상구조물로 수용액 상에서 용해 되지 않고 다량의 물을 함유할 수 있는 구조체를 말한다. 하이드로겔은 높은 함수율뿐만 아니라 세포외 기질(extracellular matrix)과의 물리화학적 유사성으로 인해 우수한 생체적합성을 갖는다[13]. 또한, 모노머(monomer)나 가교제(crosslinker)의 구성 비율을 조절하여 하이드 로겔의 물리화학적인 특성 조절이 쉽고 필요한 기능에 따라 맞춤형으로 개발될 수 있다[14,15]. 하이드로겔을 이용한 약물 전달 시스템(drug delivery system)은 우수한 제어 방출(controlled release) 특성, 생 분해성(biodegradability), 그리고 국소 부위 전달(localized delivery) 특성 등 부작용을 최소화하고 치료 효율을 향상시킬 수 있는 능력으로 많은 주목을 받고 있다[16,17]. 주입형 하이드로겔(injectable hydrogel) 은 최소한의 침습법을 이용한 생체 내 주입이 가능하기 때문에 국소 부위 약물 전달을 위해 환부의 절제가 필요 없다[18]. 또한, 졸(sol) 상태에서 겔(gel) 상태로 상전이 능력을 가지고 있어 주사기를 통해 체내에 주입된 후에는 약물, DNA, 단백질 및 세포를 지속적이고 제어된 방식으로 내재화하고 방출하는 데 필요한 겔 상태를 형성할 수 있다 [19]. 따라서, 주입형 하이드로겔을 이용한 국소 부위 암 치료(localized cancer therapy)는 치료 지속 시간의 연장, 낮은 부작용 및 환자의 부담을 덜어줄 수 있는 효과적인 약물전달시스템으로써 다양한 연구가 진행되고 있다[20-23].

    ROS는 세포 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 하지만, ROS의 과발현 및 상승은 세포의 항상성을 방해하여 산화 스트레스와 관련된 질병을 일으킬 수 있다[24]. 티오케탈기(thioketal)는 ROS에 의해 빠르게 분해될 수 있으며 종양미세환경(tumor microenvironment)의 높은 ROS 농도나 외부의 자극을 통한 ROS의 발생으로 티오케탈기가 분해 되어 높은 선택성을 가진 효과적인 생분해성 약물전달체로 활용될 수 있다[25,26].

    따라서, 본 연구에서는 효과적인 종양 국소 부위 광역학 치료를 위해 ROS에 의해 선택적으로 분해가 가능한 가교제를 사용하여 가교 밀도를 제어함으로써 온도 반응성 고분자인 poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) 기반의 주입형 하이드로겔을 합성하였다. 또한 낮은 표적성 및 소수성의 광증감제 chlorin e6 (Ce6)을 담지한 PNIPAM-C/PS 주입형 하이드로겔을 제조하였다. 광증감제 Ce6의 여기(excitation) 파장인 670 nm 파장의 빛을 조사하여 발생하는 일항 산소(singlet oxygen)에 의한 하이드로겔의 분해 특성, 광역학 치료 효과 및 물리화학적인 특성을 살펴보았다.

    2. 실 험

    2.1. 시약

    Acryloyl chloride (AC), ammonium persulfate (APS), N-isopropylacrylamide (NIPAM), N,N,N’,N’-tetramethylethyenediamine (TMEDA), N,N’-methylene bisacrylamide (MB), 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF), dichloromethane (DCM), lithium aluminum hydride, thioglycolic acid 는 Sigma-Aldrich Chemical에서 구입하였고 Ce6는 Frontier Scientific, Inc. (Logan, UT) 제품을 사용하였다. Hydrochloric acid (HCl), acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), triethylamine (TEA), acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), 그리고 ethyl ether는 Samchun Pure Chemical Co., Ltd. (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phosphate buffered saline (PBS), 0.25% trypsin-EDTA, fetal bovine serum (FBS), 그리고 penicillin-streptomycin 는 HyClone Laboratories, Inc. (Logan, UT, USA)에서 구입하였고, cell viability assay kit (CCK-8)는 DoGenBio Co., Ltd. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 시약은 별도의 정제과정을 거치지 않고 그대로 사용하였다.

    2.2. ATK의 합성

    티오케탈기를 포함하는 가교제의 합성은 총 3단계로 진행되었다 (Figure 1A). 먼저, dicarboxyl group-terminated thioketal (CTK)을 합성하기 위해 thioglycolic acid (70%) 21.0 mL (2.565 mmol)를 아세톤 9.0 mL (0.413 mmol)와 혼합하여 N2 분위기, 50 °C 조건에서 72 h 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 생성물을 25 °C로 냉각시키고 얼음물로 반복해서 세척한 후 얻은 생성물을 동결 건조하여 CTK를 얻었다. 두 번째로, dihydroxyl group-terminated thioketal (HTK)은 LiAlH4 환원제를 사용하여 CTK의 양쪽 말단 카르복실기를 하이드록시기로 환원시켜 합성했다. 4-neck 플라스크에 LiAlH4 (0.105 mol)를 먼저 넣은 후, dropping funnel을 이용해서 CTK (8.929 mmol)가 용해된 무수 THF를 ice-bath에서 일정한 속도로 떨어뜨렸다. 그런 다음, 혼합 용액을 52 °C에서 2 h 동안 교반하였고, 반응이 끝난 후 합성된 용액은 실온 상태가 될 때까지 냉각했다. 다음으로, 과량의 LiAlH4를 quenching하기 위해, 탈이온수와 15% NaOH 수용액을 ice-bath에서 반응 혼합물에 천천히 첨가하였다. 그리고 나서 1.0 M HCl 용액을 반응 혼합물에 천천히 첨가하여 형성된 에멀전 상을 액체 상태로 분리시켰으며 회전증발농축기를 이용해 과량의 무수 THF를 제거하였다. 위 과정에서 얻어진 농축액은 ether를 이용하여 추출하였고 진공 건조를 통해 HTK를 얻었다. 마지막으로, diacryl group-terminated thioketal (ATK)은 HTK와 AC의 반응에 의해 합성되었다. 먼저, HTK (0.51 mmol)와 TEA (1.53 mmol)를 무수 DCM (5.0 mL)에 용해시켰다. 그런 다음, 무수 DCM (4.0 mL)과 AC (2.55 mmol)의 혼합물을 dropping funnel에 넣어 준비하였다. N2 분위기 하에 ice-bath에서 일정한 속도로 HTK와 TEA가 포함된 혼합 용액에 DCM과 AC 혼합물을 떨어뜨린 후, 6 h 동안 교반하였다. 그 다음, 미반응물을 제거하기 위해 생성물을 진공 필터링 후에 탈이온수로 반복해서 세척하고 진공 오븐에서 건조하여 ATK를 얻었다.

    2.3. 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 합성

    ATK의 조성을 변화시켜 ROS-분해 가능한 ATK로 가교된 NIPAM 기반 주입형 하이드로겔 (PNIPAM-C)을 합성했다(Table 1). NIPAM pre-gel 수용액은 2.9 mL의 탈이온수에 1.873 mmol의 NIPAM 단량체를 용해시켜 제조했다. NIPAM pre-gel 수용액을 가교제인 ATK (0.008~0.064 mmol), 가속제인 TMEDA (0.112 mmol)와 혼합했다. 혼합물의 용존 산소를 제거하기 위해 건조 질소 가스를 20 min간 주입한 후, 개시제인 APS (0.011 mmol)를 첨가했다. 다음으로, 혼합 용액을 365 nm 파장의 UV 조사(255 μW/cm2) 하에 20 min 동안 노출시켰다. 24 h 후, 생성된 하이드로겔을 탈이온수로 세척하여 미반응물을 제거했다. 비교군으로, MB 가교제로 가교된 PNIPAM-MB 하이드로 겔도 동일한 방법으로 합성했다.

    2.4. 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 LCST 거동 분석

    PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 상전이는 UV-vis 분광기를 사용하여 측정했다. 하이드로겔의 lower critical solution temperature (LCST) 거동은 PNIPAM-C3 하이드로겔 300 mg을 이용하여 30~40 °C의 온도 범위에서 0.5 °C의 간격으로 온도를 변화시켜 가며 하이드로겔의 투과도를 측정하여 분석하였다. 하이드로겔 샘플의 LCST는 투과율 대 온도 곡선에서 변곡점의 x 좌표로 측정하였다. 비교군으로 PNIPAM-MB 하이드로겔도 같은 방법으로 LCST를 측정하였다.

    2.5. 광증감제가 담지된 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 제조

    광증감제 Ce6를 PNIPAM-C3 하이드로겔에 담지하기 위해, 먼저 PNIPAM-C3 하이드로겔 중량의 1 wt%, 3 wt% 그리고 5 wt%의 Ce6 를 DMSO와 증류수 혼합물(1.5:8.5 부피비)에 용해시켰다. 제조한 광 증감제 Ce6 용액에 200 mg의 PNIPAM-C3 하이드로겔 샘플을 24 h 동안 담가 하이드로겔에 Ce6를 로딩하였다(Table 2). 잔여 DMSO는 25 °C와 40 °C의 탈이온수로 번갈아가며 반복적으로 워싱하여 제거하였다.

    2.6. 일항 산소 발생

    Ce6가 담지된 PNIPAM-C3/PS 주입형 하이드로겔에서 생성된 일항 산소는 일항 산소에 매우 반응성이 높은 DPBF의 광표백(photobleaching) 특성을 이용하여 측정하였다. 먼저 동일한 Ce6 로딩 양을 갖는 PNIPAM-C3/PS3 샘플(30 mg)을 석영셀(quartz cuvette)에 넣고 acetonitrile 3 mL와 DPBF (2 mM) 용액 150 μL를 첨가하였다. 30 min 후, 각 샘플에 670 nm 레이저(2, 4, 6 mW/cm2)를 10 s 간격으로 50 s 동안 조사하였다. 또한, 동일한 670 nm 레이저 세기로 조사 하에 서로 다른 Ce6 로딩 양을 갖는 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔을 이용하여 동일한 방법으로 일항 산소의 발생 특성을 관찰하였다. 일항 산소와의 반응에 다른 DPBF의 흡광도(412 nm)의 감소를 UV-vis 분광기로 측정하였다.

    2.7. PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 분해

    ROS에 의한 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔의 분해는 670 nm 레이저를 조사하여 관찰하였다. PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔 샘플 10 mg를 마이크로 튜브에 넣고, 670 nm 레이저를 5일 동안 매일 6 mW/cm2의 세기로 10 min씩 조사하였다. 670 nm 레이저 조사에 의한 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔의 분해 거동은 레이저 조사 전/후 사진을 통해 확인하였다.

    2.8. In vitro 세포 독성 실험

    PNIPAM-C와 PNIPAM-C/PS 하이드로겔의 in vitro 세포 독성 실험을 위해 자궁 경부암 세포인 HeLa 세포를 사용하였다. HeLa 세포는 10% FBS와 1%의 penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 5% CO2, 37 °C 조건하에 24-well plate에 1 × 105 cell/well의 농도로 seeding한 후 세포의 부착을 위해 24 h 동안 배양했다.

    먼저 주입형 하이드로겔의 암독성(dark toxicity)을 알아보았다. ATK 가교제의 양에 따른 PNIPAM-C3, PNIPAM-C4 PNIPAM-C5, 그리고 PNIPAM-C6 30 mg을 각 well에 넣고 24 h 동안 배양하였다. 다음으로, 하이드로겔 샘플을 제거하고 PBS로 3회 워싱하고 난 후 새로운 DMEM 배지 1 mL를 추가하여 각 well 당 20 μL의 CCK-8 용액을 첨가하였다. 2 h 동안 배양한 후, 마이크로 플레이트 리더(microplate reader, Infinite 200 PRO, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. 또한, 광증감제가 담지된 PNIPAMC/ PS 주입형 하이드로겔의 분해 전/후 in vitro 독성을 알아보기 위해 670 nm 레이저를 조사하기 전 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔과 레이저를 5일 동안 조사한 후 분해된 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔 30 mg씩을 이용해 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.

    다음으로, 670 nm 레이저 조사에 의한 광독성(phototoxicity) 실험을 진행하였다. 먼저, 670 nm 파장의 레이저가 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 1 mW/cm2, 5 mW/cm2 , 그리고 10 mW/cm2 세기의 레이저를 HeLa 세포에 조사하여 광독성을 확인하였다. 다음으로, 레이저 세기와 Ce6 로딩 양에 따른 광독성을 알아보기 위해, 30 mg의 PNIPAM-C3, PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/ PS5 주입형 하이드로겔을 HeLa 세포가 seeding된 24-well plate에 함께 넣고 배양하였다. 그 다음, 주입형 하이드로겔이 포함된 세포에 670 nm 레이저를 1, 5, 10 mW/cm2의 세기로 5 min 동안 각각 조사하 였으며 24 h 동안 추가 배양한 후 CCK-8 assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. CTK, HTK, ATK 합성 및 특성 분석

    ROS-분해 가능한 티오케탈 가교제의 합성을 위한 각 단계 생성물(CTK, HTK 및 ATK)의 화학 구조는 1H-NMR 및 FT-IR 측정을 통해 확인하였다. 티오케탈기를 포함하며 양쪽 말단에 카르복실기를 갖고 있는 CTK는 -CH3, -CH2 및 -COOH로 인한 양성자 피크가 각각 1.5, 3.4 및 12.6 ppm에서 나타났다(Figure 1B). 다음으로, LiAlH4 환원제 를 이용해 CTK의 카르복실기를 환원시켜 양쪽 말단에 하이드록시기를 가진 HTK를 합성했다. HTK의 1H-NMR 스펙트럼에서 카르복실기의 양성자 피크는 12.6 ppm에서 사라졌고, 하이드록시기의 –OH 양성자 피크가 4.9 ppm에서 관찰되었다(Figure 1C). HTK와 AC의 에스터 결합 반응으로 ATK를 합성했다. 5.9~6.3 ppm 범위에서 양쪽 말단의 아크릴기로 인한 양성자 피크와 -CH2 및 -CH3의 양성자 특성 피크는 각각 4.26, 2.88 및 1.58 ppm에서 나타났다(Figure 1D). ATK의 1H-NMR 데이터를 기반으로 수소의 적분비를 이용하여 계산된 아크릴기 치환율은 0.96이었다[27].

    CTK, HTK 및 ATK의 FT-IR 스펙트럼을 Figure 2A에 나타내었다. CTK는 약 1694 cm-1 및 2968 cm-1에서 각각 카르복실기의 C=O 및 O-H로 인한 신축 진동 피크(stretching vibration peak)를 보였다. HTK 의 경우 C=O 신축 진동 피크가 사라지고 3310 cm-1에서 크고 강한 O-H 피크가 관찰되었다. 이는 CTK의 말단 카르복실기가 HTK에서 하이드록실기로 환원되었음을 보여준다. 또한, ATK는 아크릴기의 C=C 신축 진동 피크가 1632 cm-1에서 명확하게 관찰되었다. 이러한 1H-NMR과 FT-IR 측정 결과로부터 CTK, HTK, ATK 가교제가 단계 별로 성공적으로 합성되었음을 확인할 수 있었다.

    3.2. 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔(PNIPAM-C)의 제조

    PNIPAM-C 주입형 하이드로겔은 NIPAM 단량체와 티오케탈 결합을 포함한 ATK 가교제를 사용하여 합성되었다. Table 1에 나타낸 바와 같이 다양한 조성의 주입형 PNIPAM-C 하이드로겔은 ATK의 공급 비율을 조절하여 제조되었다. Figure 2B에서 NIPAM 단량체, ATK 가교제, 그리고 PNIPAM-C3 하이드로겔의 FT-IR 스펙트럼을 확인할 수 있다. NIPAM 단량체는 C=C 및 C=O 신축 진동 피크가 각각 1621 cm-1과 1658 cm-1에서 나타났고, N-H 특성 피크는 3281 cm-1에서 관찰되었다. 또한, 1624 cm-1과 1721 cm-1에서 ATK 가교제의 C=C, C=O 특성 피크를 확인할 수 있다. 반면에, NIPAM 단량체 및 ATK 가교제의 아크릴기에서 관찰되는 C=C 신축 진동 피크(1617~1629 cm-1)는 PNIPAM-C3 하이드로겔이 형성됨에 따라 사라지는 것을 알 수 있다 (Figure 2B(c)). 이러한 결과는 NIPAM 단량체와 ATK의 아크릴기에 존재하는 C=C 이중 결합이 광개시에 의해 라디칼 중합 및 가교 되면서 PNIPAM-C3 하이드로겔 폴리머 네트워크를 형성했다는 것을 나타 낸다.

    다음으로, ATK 가교제의 함량을 조절하여 제조한 PNIPAM-C 하이드로겔의 사진을 Figure 3A에 나타냈다. ATK 가교제의 양이 가장 적은 PNIPAM-C1 하이드로겔은 낮은 가교도로 인해 겔의 일부분이 워싱 과정 중에 소실되는 것을 확인할 수 있었고 하이드로겔 내의 ATK 가교제의 함량이 C1에서 C6으로 증가함에 따라 하이드로겔의 색이 ATK 가교제의 색으로 인해 점차 진한 적갈색으로 변하는 것을 관찰했다. 그 중에서 PNIPAM-C2, PNIPAM-C3, 그리고 PNIPAM-C4 하이드로겔은 실온에서 주사기 바늘을 통해 주입 가능한 반면에, 가교도가 높은 PNIPAM-C5와 PNIPAM-C6 하이드로겔은 주입이 불가능하였다. 따라서, 주입 가능한 하이드로겔 중 PNIPAM-C3 하이드로겔을 사용하여 추후의 실험을 진행하였다. 또한, PNIPAM-C3에 사용된 ATK 가교제와 같은 몰수의 MB 가교제를 통해 합성된 PNIPAM-MB 하이드로겔은 높은 가교도로 인해 주입이 불가능했다. 다음으로, PNIPAM-C3 하이드로겔의 주입 가능한 특성을 Figure 3B에 나타내었 다. PNIPAM-C3 하이드로겔을 주사기에 넣고, 바늘을 통해 방출했을 때 원하는 형태로 방출이 가능했고 하이드로겔이 부서지거나 하는 물성의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 티오케탈 가교제를 사용하여 가교 밀도를 조절함으로써 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔이 성공적으로 합성되었음을 의미한다.

    3.3. 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 LCST 및 온도 민감성

    PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔의 LCST 및 온도 변화에 따른 상전이 변화를 관찰하였다. 먼저 온도 변화에 따른 하이드로겔의 투과율 (%)을 측정하여 주입형 하이드로겔의 LCST를 조사했다. Figure 4A에 나타낸 바와 같이, PNIPAM-MB 하이드로겔은 ~32.0 °C에서 급격한 LCST 거동을 보인 반면, PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔은 PNIPAMMB보다 더 높은 약 ~34.1 °C 온도에서 완만한 LCST 거동을 보였다. 이 결과는 친수성기를 갖는 ATK 가교제의 C=O 이중결합으로 인해 하이드로겔의 팽윤이 잘 일어나고 PNIPAM 폴리머 사슬 간의 응집이 억제되어 하이드로겔의 LCST가 증가했기 때문이다. Figure 4B는 PNIPAM-C3 하이드로겔의 온도에 따른 상전이 거동을 보여준다. 상온인 25 °C에서 PNIPAM-C3 하이드로겔은 바이알을 기울였을 때 흐르는 졸 상태였지만 인간의 체온인 37 °C에서는 바이알을 기울였을 때 하이드로겔이 수축하여 겔 모양을 유지했다. 이러한 결과는 PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔이 상온에서는 졸 상태를 유지하여 주사기를 통해 인체 내로 주입할 수 있고, LCST 이상인 인체 내 온도에서는 겔 상태로 상전이가 발생하기 때문에 국소 부위 종양 치료에 활용 가능한 주입형 하이드로겔로써의 특성을 가짐을 의미한다.

    3.4. 광증감제가 담지된 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 제조

    종양 국소 부위에 주입했을 때, ROS에 의한 PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔의 광역학 치료 효과와 티오케탈기의 결합이 끊어짐에 의한 하이드로겔의 분해를 위해 널리 사용되는 광증감제인 Ce6를 하이드로겔 내부에 담지하였다. PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔 중량의 1, 3, 그리고 5 wt%에 해당하는 Ce6를 혼합 용액(DMSO:DI Water = 1.5:8.5 부피비)에 용해시키고 하이드로겔을 24 h 동안 dipping하여 로딩한 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔의 UV-vis 흡광도를 측정했다. PNIPAM-C3/PS1, PNIPAMC3/ PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔 샘플에서 660 nm 근방에서 나타나는 free Ce6의 특성 피크를 확인할 수 있었고, Ce6가 로딩되지 않은 PNIPAM-C3에서는 free Ce6의 특성 피크가 관찰되지 않았다. 로딩 용액에서 Ce6의 함량이 1, 3, 그리고 5 wt%로 증가함에 따라 Ce6의 특성 피크의 흡광도가 점차적으로 높아지는 경향을 나타냈다(Figure 5A). 또한, PNIPAM-C3과 PNIPAM-C3/PS3 하이드로겔의 사진을 통하여 Ce6 로딩 전/후의 하이드로겔 형태를 확인하였다. Ce6가 로딩되지 않은 PNIPAM-C3 하이드로겔은 투명한 색을 나타내었으나, 3 wt%의 Ce6 용액으로 로딩한 PNIPAM-C3/PS3 하이드로겔의 경우 Ce6의 색인 진한 청록색을 띠었다. 또한, 광증감제 Ce6의 담지 전과 후에 하이드로겔의 모양 및 물성은 큰 변함이 없었다(Figure 5B).

    3.5. 광증감제가 담지된 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 ROS 발생 특성

    670 nm 레이저의 조사 세기에 따른 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이 드로겔의 ROS 생성 특성을 DPBF의 광표백에 의한 흡광도의 변화를 통해 확인하였다. 주입형 하이드로겔에 Ce6의 여기 파장인 670 nm 레이저를 조사하면 하이드로겔 내의 Ce6가 빛을 흡수하고 주변 산소 분자로 에너지를 전달하여 ROS의 종류인 일항 산소를 생성한다. 일항 산소의 발생량은 생성된 일항 산소가 DPBF와 반응함에 따라 간접적으로 측정할 수 있다[28]. Figure 6과 Figure 7에 나타낸 바와 같이, 일항 산소의 발생으로 인해 412 nm에서 DPBF의 특성 피크가 점차 감소하는 것을 알 수 있다. PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔은 670 nm 파장의 레이저 세기가 2, 4, 그리고 6 mW/cm2으로 증가함에 따라 일항 산소의 발생량도 37.7, 46.4, 그리고 88.2%로 점차적으로 증가하였다(Figure 6A-D). 이는 670 nm 레이저의 조사 세기가 증가함에 따라 광증감제인 Ce6의 여기가 더 활발히 발생하고 그로 인해 더 많은 일항 산소가 발생했기 때문이다. 또한, 4 mW/cm2의 동일한 레이저 세기 조건 하에 Ce6 로딩 양이 각각 다른 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 하이드로겔로부터 발생하는 일상 산소의 생성 결과를 Figure 7에 나타내었다. Ce6의 로딩 양이 PS1에서 PS5로 증가함에 따라 일항 산소의 발생 양이 12.4, 46.4, 그리고 71.4%로 점점 증가했다. 이는 하이드로겔 내부에 존재하는 Ce6 의 농도가 증가함에 따라 발생하는 일항 산소의 양이 점차 증가했음을 의미한다(Figure 7A-D). 이러한 결과를 통해 PNIPAM-C/PS 주입형 하이드로겔에서 일항 산소의 생성이 레이저의 세기와 Ce6 로딩 양에 의해 제어될 수 있음을 확인할 수 있었다.

    3.6. 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔의 분해

    티오케탈 그룹은 ROS에 의해 효과적으로 결합이 분해될 수 있는 ROS 민감성 화학 구조 중 하나이며 in vitro 또는 in vivo 내에서 일정 수준의 ROS에 노출되면 무독성의 티올과 아세톤으로 쉽게 분해될 수 있다[26,29]. 따라서 티오케탈 그룹을 포함하는 ATK 가교제를 사용하여 가교된 주입형 하이드로겔은 ROS 발생에 의해 선택적으로 분해될 수 있다. Figure 8은 PNIPAM-C3/PS3 하이드로겔을 6 mW/cm2 세기의 670 nm 레이저를 매일 10 min씩 조사하면서 관찰한 하이드로겔 사진이다. 670 nm 레이저를 조사를 하지 않은 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔 샘플은 5 일차까지 마이크로 튜브에서 분해되지 않고 본래의 모양을 유지하면서 부착되어 있는 모습이 관찰되었다. 반면, 매일 10 min씩 670 nm 레이저를 조사한 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔 샘플은 2 일차부터 서서히 분해되기 시작하여 점차 아래로 흐르는 모습을 보였고, 5 일차에는 전부 분해되어 본래의 모양을 유지하지 못하고 마이크로 튜브 바닥으로 완전히 분리되어 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 주입형 하이드로겔은 670 nm 파장의 레이저 조사 시 생성된 일항 산소에 의해 분해될 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 PNIPAM-C3/PS3 주입형 하이드로겔은 국소 부위의 종양에 주입된 후 레이저를 조사하면 발생한 ROS에 의해 광역학 치료 효과를 나타냄과 동시에 서서히 분해되면서 인체 내에서 제거가 될 수 있음을 의미한다.

    3.7. In vitro 세포 독성 실험

    광역학 치료를 이용한 국소 부위 종양 치료를 위해 PNIPAM-C 및 PNIPAM-C/PS 주입형 하이드로겔의 세포 독성 실험을 자궁경부암 세포인 HeLa 세포주를 이용하여 진행하였다. 먼저, 670 nm 레이저를 조사하지 않았을 때, ATK 가교제의 양 및 담지된 Ce6의 양에 따른 주입형 하이드로겔의 세포 생존율을 CCK-8 assay를 이용해 분석하였다. 먼저, ATK 가교제의 양이 다른 PNIPAM-C3, PNIPAM-C4, PNIPAMC5, 그리고 PNIPAM-C6 하이드로겔을 HeLa 세포와 함께 24 h 배양한 후 670 nm 파장의 레이저 조사 없이 측정한 세포 생존율을 Figure 9A에 나타내었다. 레이저를 조사하지 않았을 때 각각의 하이드로겔은 전부 97.4% 이상의 우수한 세포 생존율을 나타냈고, 이를 통해 ATK 가교제의 증가에 따른 하이드로겔의 생체 내 독성은 현저히 적다는 것을 알 수 있었다. 또한, Ce6가 로딩된 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAMC3/ PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 주입형 하이드로겔과 670 nm 파장의 레이저를 조사하여 분해된 하이드로겔의 세포 독성을 조사하였다. Ce6의 로딩 양이 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAMC3/ PS5로 점차 증가함에도 불구하고 세포 생존율은 97.3% 이상으로 측정되었고, 레이저 조사 후 분해된 하이드로겔 또한 93.1% 이상의 우수한 생체적합성을 나타내었다(Figure 9B). Figure 9C는, 670 nm 레이저 조사에 의한 HeLa 세포의 손상을 알아보기 위해 1 mW/cm2, 5 mW/cm2, 그리고 10 mW/cm2의 세기로 5 min 동안 조사하였을 때의 세포 생존율을 나타낸 것이다. 대부분의 세포는 1 mW/cm2, 5 mW/cm2, 그리고 10 mW/cm2의 세기에서 모두 98.2% 이상의 세포 생존율을 보였으며 이는 곧 670 nm 레이저 조사가 세포에 치명적인 손상을 입힐 정도의 독성을 나타내지는 않았음을 의미한다. 마지막으로, 광역학 치료 효과에 의한 광독성 실험을 위해, PNIPAM-C3, PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 주입형 하이드로겔을 HeLa 세포와 함께 1 mW/cm2, 5 mW/cm2, 그리고 10 mW/cm2 세기의 670 nm 레이저로 5 min 동안 조사한 후, 24 h 추가 배양하여 CCK-8 assay 분석을 진행하였다. Figure 9D를 보면 Ce6가 로딩되지 않은 PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔은 ROS가 발생하지 않아 광역학 치료 효과가 없기 때문에 레이저의 세기가 1, 5, 그리고 10 mW/cm2으로 증가함에도 불구하고 전부 95.2% 이상의 높은 세포 생존율을 보였다. 반면에, Ce6가 로딩된 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 주입형 하이드로겔은 Ce6의 로딩 양이 증가할수록 광역학 치료 효과의 상승으로 인해 점차 세포 생존율이 낮아지는 것이 관찰되었고, 마찬가지로 670 nm 파장의 레이저 세기가 1, 5, 그리고 10 mW/cm2으로 증가할수록 같은 Ce6 로딩 양의 샘플과 비교했을 때 더 높은 세포 독성을 나타내었다. 결과적으로, PNIPAM-C/PS 하이드로겔은 레이저를 조사하지 않았을 때는 독성을 나타내지 않았지만, 레이저 조사를 통해 발생한 ROS에 의해 광역학 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다

    4. 결 론

    본 연구에서는 ROS에 의한 선택적 분해 특성을 갖는 ATK 가교제를 사용하여 종양 국소 부위 광역학 치료를 위한 활성 산소 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔(PNIPAM-C3/PS3)을 합성하였다. 티오케탈 작용기를 포함하는 ATK 가교제와 ROS 생성을 위한 광증감제인 Ce6의 로딩 양을 조절하여 종양 국소 부위에 주사 가능한 분해형 하이드로겔 물성의 최적 조건을 확립하였다. ROS에 의해 분해 가능한 ATK 가교제의 합성을 FT-IR과 1H-NMR 분석을 통해 확인하였다. PNIPAM-C3 주입형 하이드로겔은 약 34.1 °C의 온도에서 LCST를 나타내어 상온에서는 졸 상태를 유지하여 주사기를 통해 체내로 주입할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 670 nm 파장의 레이저로 조사할 때 ROS에 의한 하이드로겔의 분해 가능성을 확인하였다. 레이저를 조사하지 않는 조건하에서는 PNIPAM-C 및 PNIPAM-C/PS 하이드로겔 모두 97% 이상의 높은 세포 생존율을 나타냈으며, 레이저 조사 후 분해된 PNIPAM-C/PS 하이드로겔 샘플도 93% 이상의 세포 생존율로 우수한 생체 적합성을 나타내었다. 또한, Ce6가 로딩된 PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, 그리고 PNIPAM-C3/PS5 주입형 하이드로겔은 Ce6의 로딩 양과 레이저의 세기가 증가할수록 광역학 치료 효과의 상승으로 점차 낮은 세포 생존율을 나타냈다. 따라서, 본 연구에서는 ROS 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔 (PNIPAMC3/ PS3)이 670 nm 레이저 조사 시 생성된 ROS에 의해 우수한 광역학 치료 효과를 나타낼 수 있으며 체내에서 독성의 거의 없는 형태로 서서히 분해될 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 ROS 분해성 PNIPAM 기반 주입형 하이드로겔이 효과적인 종양 국소 부위 광역학 치료를 위한 유망한 후보 물질이 될 수 있음을 확인하였다.

    감 사

    이 논문은 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2021R1I1A2059144).

    Figures

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    (A) Synthesis of ATK crosslinker; 1H-NMR spectra of (B) CTK, (C) HTK, and (D) ATK.
    ACE-35-6-530_F2.gif
    FT-IR spectra of (A) (a) CTK, (b) HTK, and (c) ATK; (B) (a) NIPAM monomer, (b) ATK, and (c) PNIPAM-C3 hydrogel.
    ACE-35-6-530_F3.gif
    Photographs of (A) PNIPAM-MB and PNIPAM-C hydrogel according to the content of ATK crosslinker; (B) injectability of PNIPAM-C3 hydrogel.
    ACE-35-6-530_F4.gif
    (A) Temperature-dependent optical transmittance of PNIPAMMB and PNIPAM-C3 hydrogel by UV-vis spectroscopy; (B) images of sol-gel transition of PNIPAM-C3 hydrogel at 25 °C and 37 °C.
    ACE-35-6-530_F5.gif
    (A) UV spectra of free Ce6, PNIPAM-C3, PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, and PNIPAM-C3/PS5 injectable hydrogel; (B) photograph of (a) PNIPAM-C3 and (b) PNIPAM-C3/PS3 injectable hydrogel.
    ACE-35-6-530_F6.gif
    The absorption spectra of DPBF by photodegradation of PNIPAM-C3/PS3 recorded every 10 s depending on 670 nm laser intensity at (A) 2 mW/cm2, (B) 4 mW/cm2, and (C) 6 mW/cm2; (D) relative DPBF concentration.
    ACE-35-6-530_F7.gif
    The absorption spectra of DPBF by photodegradation of (A) PNIPAM-C3/PS1, (B) PNIPAM-C3/PS3, and (C) PNIPAM-C3/PS5 injectable hydrogel recorded every 10 s depending on Ce6 concentration at 4 mW/cm2 intensity of 670 nm laser; (D) relative DPBF concentration.
    ACE-35-6-530_F8.gif
    Photodegradation of PNIPAM-C3/PS3 injectable hydrogel under the irradiation of 670 nm laser at 4 mW/cm2 intensity every 10 min for 5 days.
    ACE-35-6-530_F9.gif
    In vitro dark toxicity of (A) PNIPAM-C hydrogel according to ATK concentration; (B) PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, and PNIPAM-C3/PS5 injectable hydrogel before and after degradation; In vitro phototoxicity of (C) 670 nm laser according to the laser intensity (1, 5, 10 mW/cm2) for 5 min against HeLa cells; (D) PNIPAM-C3, PNIPAM-C3/PS1, PNIPAM-C3/PS3, and PNIPAM-C3/PS5 injectable hydrogel according to the laser intensity for 5 min against HeLa cells.

    Tables

    Composition of PNIPAM-based Injectable Hydrogel According to ATK Amounts
    a) C represents the ATK crosslinker. b) Total volume of the pre-gel solution was 3 mL. c) N,N’ -methylene bisacrylamide (MB).
    d) Injectability of PNIPAM-based hydrogel was confirmed by injection using a 19 gauge syringe needle at room temperature (○: injectable, ×: non-injectable, △: injectable but non-cohesive hydrogel).
    Preparation of PNIPAM-C/PS Hydrogel
    a) PS represents photosensitizer Ce6.
    b) Total volume of dipping solution was 1 mL of DMSO and H2O mixture (1.5:8.5 volume ratio) and the weight of PNIPAM-C3 hydrogel was 200 mg.

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