1. 서 론

액상에서의 농도 측정은 high-performance liquid chromatography (HPLC), inductively coupled plasma (ICP), 분광계, 또는 두 개 이상의 농도 측정 기술이 결합된 형태의 분석기기를 이용하며 화학, 바이오, 나노재료, 촉매 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다[1-5]. 광학기기 중에 자외선가시광선분광법은 액상에서의 다양한 물질의 농도를 측 정하는 데 사용하는 데 널리 사용되고 있고[6] 시료의 광학적 흡수 파 장을 이용해 정량적 농도를 측정할 수 있다. 이러한 광학적 특성을 이 용한 분석기기는 HPLC[7-12] 또는 ICP[13-16]와 비교할 때 column의 선택이나 이온화와 같은 전처리 필요성이 없어 유용하다. 자외선가시 광선분광법을 이용한 농도 분석은 용액의 흡수율은 용액 내 흡수 종 의 농도와 경로 길이에 정비례한다는 Beer 법칙에 기초한다[17]. 따라 서 자외선가시광선분광법의 장점은 단순성, 다기능성, 정확성, 속도 및 비용 효율성으로 정량 및 정성 분석, 액상에서의 반응속도 관측, 분자 수준에서 메커니즘 정의 등이 가능하다[18-25]. 하지만 자외선가 시광선분광기의 실제 작동 범위는 200~800 nm이며 이 외의 범위는 분석의 유효성이 떨어지고 용매에 따라 cutoff 파장을 고려해 선택해 야 한다[25,26]. 또한 고농도 시료일수록 물질 간 활발한 상호작용이 발생하여 Beer의 법칙에서 벗어나 농도와 흡광도 사이 비선형이 나타 나게 되어[25] 고농도 시료 분석을 위해서는 희석하여 측정하고 농도 를 추정하는 과정이 필요하다.

색상 분석법은 화학, 환경, 화장품 등의 분야에서 색상 좌표를 활용 하여 빠른 색체 및 농도 분석에 활용되고 있다[27-30]. 색상 분석에 사 용되는 색 공간은 RGB, HSV, CIE LCH, -CIE L*a*b*, CIE xyY, CIE Yu’v’, CMYK 등이 있으며 색상 분석을 통한 농도 분석은 높은 처리 량, 짧은 분석 시간, 향상된 성능 및 신뢰성, 실시간 분석의 가능성 등 다양한 이점을 가지고 있다[27,28]. 이러한 분석법을 이용하여 RGB 또는 HSV 모델을 사용한 색상 분석을 통해 15 min 내에 150개 샘플 의 빠른 분석 가능하며[27], 토양 속 필요한 물의 양, 이온 농도, pH, 경도 관측 등에 이용되고 있다[27-30]. 색상 분석은 빠른 측정이 가능 하지만 주로 정적 상태에서 저농도와 양을 측정하는 데 이용되어 왔 고 시간에 따라 농도와 양이 변하는 촉매 반응 등에는 거의 사용되지 않았다.

이 논문에서는 색상 분석을 이용한 고농도 시료의 농도 분석법을 제시하고 자외선가시광선분광법 분석 결과와 비교함으로써 유효성을 검증한다. 제시된 색상 분석을 이용한 농도 분석법은 반응 용액의 디 지털 이미지 획득, 소프트웨어를 통한 이미지의 색상 분석, 색상 좌표 와 농도 사이 관계식에 추출한 반응 용액의 색상 좌표 대입, 농도 계 산 순서로 진행된다. Resazurin (RZ)에서 Resorufin (RF)으로의 환원 반응은 단일 나노 촉매의 단일 분자 연구, 물질 전달 계수 측정 등에 이용되고 반응물과 생성물 모두 가시광선 영역에서 흡수 파장을 갖고 있어[31,32] 색상 분석의 대상 모델로 이용될 수 있다. 농도 측정 및 반응 속도 측정을 위해 RZ, RF 및 RZ 환원반응을 활용하였다. 색상 좌표와 농도 사이 관계식은 RZ과 RF의 농도 별 관계식을 얻고 이를 바탕으로 환원 반응 동안 시간 변화에 따른 RZ과 RF의 농도를 계산 하고 반응 속도를 계산하였다.

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기 구성

Resazurin sodium salt (RZ), hydroxylamine (50% in water, HA), gold nanoparticle (5 nm diameter, stabilized suspension in citrate buffer, GNP)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Resorufin sodium salt (RF)은 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하고 정제 없이 사용하 였다.

디지털 이미지 획득 방법은 이전에 제시한 방법[33]에서 확인할 수 있다. 획득 방법을 간단히 설명하면 석영 셀을 중심으로 Nikon D5600 카메라와 5 W 백색 LED를 수직 방향으로 위치하였다. 이때 각각의 거리는 15 cm이며 카메라는 ISO 1/25, F 5.6, 조리개 최대 개방 5로 세팅하였다. Wien의 변위 법칙에 LED의 온도에 따라 파장 및 강도가 바뀔 수 있기 때문에[34] LED가 일정한 온도에 도달할 때까지 10 min 이상 기다렸다. 자외선가시광선분광법 분석과 동일한 조건에서 실험 하기 위해 석영 셀을 사용하고 5 W 백색 LED를 15 cm 거리에서 조 사하였다.

2.2. 실험 방법

고농도의 용액의 농도 분석을 위해 RZ와 RF의 혼합물의 총 농도를 200, 400, 600, 800, 1000 μM를 HA 9 mM를 용매로 하여 준비하고 각각의 농도에서 RZ와 RF의 100, 80, 60, 40, 20, 0%의 비율로 혼합 을 하고 각각의 농도는 Table 1과 같다. 고농도(초기 농도: 200 μM RZ)에서의 반응 속도를 계산하기 위해 RZ 800 μM 1 mL, HA 20 mM 1.8 mL, 5 nm GNP 0.321 mM 1.2 mL를 혼합하여 상온에서 반응을 일으켜주었다. 자외선가시광선분광기를 이용하여 5 min마다 흡수 파 장을 얻고 카메라를 이용해 30 s마다 디지털 이미지를 얻었다. RZ 환 원 반응의 반응 속도를 자외선가시광선분광법으로 분석하기 위해 시 간에 따라 얻어진 용액의 일부를 채취하여 반응 속도를 낮추고 기기 분석이 가능하도록 20배 희석하여 이전에 방법[33]으로 계산하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 자외선가시광선분광법을 고농도 분석의 한계

Figure 1은 RZ와 RF의 농도에 따른 자외선가시광선분광법의 최대 흡광도를 표시한 그래프이다. RZ와 RF의 최대 흡광도는 각각 601 nm 와 571 nm에서 나타나며[33,35] 농도 5, 20, 50, 100 μM에서의 RZ와 RF의 흡광도는 단조 증가한다. 점선으로 표시되었듯이 RZ와 RF 농도 에 따른 최대 흡광도는 50 μM까지는 선형으로 증가하고 하는데 이는 일반적으로 Beer 법칙을 적용할 수 있는 범위이다. 50 μM 이상의 RZ 와 RF는 선형성에서 벗어나게 되며 100 μM 이상에서는 자외선가시 광선분광기에서의 측정할 수 있는 흡광도 범위를 벗어난다. 따라서 Beer 법칙에 따른 RZ와 RF의 농도 분석 범위는 약 50 μM 이내로 한 정되며 고농도의 시료에 대해서는 희석하여 측정하여야 자외선가시 광선분광기를 이용한 농도 측정이 가능하다.

3.2. 고농도 시료의 색상 분석

Figure 2a는 5 W 백색광 LED를 15 cm 거리에 둔 상태에서 RZ와 RF의 혼합물의 농도와 RZ 비율에 따른 디지털 이미지이다. 상대적으 로 낮은 농도인 200 μM에서는 RZ의 비율이 높을 때 푸른 색, RF의 비율이 높을 때는 붉은 계열의 색을 나타낸다. 전체 농도가 높아짐에 따라 RZ의 농도가 높을 때는 보라색, RF의 농도가 높을 때는 오렌지 색을 보인다. 자외선가시광선분광기 의 흡수 파장은 약 450 nm부터 700 nm까지의 좁은 가우시안 분포 형태가 아닌 한쪽으로 치우친 분 포를 보이며[33,35] 각각의 파장에서의 고농도에서 농도에 따라 흡광 도가 비선형과 선형이 혼재되어 나타난다. RZ와 RF의 최대 흡수 파 장인 601 nm와 571 nm는 시각적으로 주황색과 노란색이며 농도가 높 아지면서 Figure 2에서 보듯이 최대 흡수 파장의 흡수도가 다른 파장 과 비교할 때 상대적 낮아지면서 주황색과 노란색의 투과도가 높아지 는 효과를 보이므로 푸른색인 RZ는 시각적으로 보라색, 붉은 색인 RF 는 시각적으로 주황색으로 보인다. 따라서 농도가 높아짐에 따라 RZ 와 RF는 넒은 스펙트럼에서 농도에 따른 흡광도가 비선형적으로 바 뀐다. 색상을 이용한 분석법에서도 전체 스펙트럼의 비선형성으로 인 해 superposition principle을 적용할 수 없어 이전 연구결과와 같은 선 형식을 사용할 수 없다. 이러한 농도와 흡광도의 비선형성 관계를 갖 는 영역에서의 색상과 농도의 관계식을 얻기 위해서 다양한 농도와 다양한 비율의 RZ와 RF 혼합물 이용해 분석하였다.

Figure 2b는 Figure 2a의 디지털 이미지를 분석하여 RZ + RF 농도, RZ 비율, 색상 공간을 변수를 사용한 2차식을 피팅하여 전체 농도와 RGB의 R값에 따른 RZ의 비율을 계산할 수 있는 그래프이다. 전체 농 도와 RZ의 비율에 따른 RGB의 R값은 볼록한 곡면을 가진다. 전체 농 도와 R값으로 RZ의 비율을 구하는 형태로 그래프를 변형하면 Figure 2b과 같이 오목한 곡면을 갖는다. 전체 농도가 일정할 때 R값에 따른 RZ의 비율은 단조 증가하는 것을 보여주지만 동일한 RZ의 비율에서 R과 전체 농도에 관계는 극값을 가지는 함수 형태를 보여준다. 따라 서 이 그래프를 통해 RZ와 RF가 동시에 존재하는 경우에는 superposition principle이 적용되지 않음을 확인할 수 있다. RZ와 RF로 구 성된 이성분계의 액상의 농도에 대한 관계를 얻기 위해서 RZ + RF 농도, RZ 비율, 색상 공간을 변수로 비선형 관계식을 구하였다. 비선 형 관계식은 실험식을 이용할 수 있으며 다항식, 삼각함수, 지수함수 등과 같은 다양한 실험식 중에서 농도에 따라 단조증가하는 흡광도의 특성으로 식 (1)과 같은 다항식을 이용하였다.

여기서 x는 RZ와 RF 혼합 농도, y는 추출한 색상 좌표, Z는 전체 혼합 용액에서 RZ의 비율(%)을 나타내며 Z₀, A, B, C, D, E는 관계식에 포 함되는 상수 값이다. 다양한 색상 공간에 관해서 실험식에 적용하였 는데 상관관계도가 가장 높게 나온 색상 공간은 RGB이었으며 2차 다항식에서 상관관계가 높게 나왔다. 관계식에 포함되는 상수 값인 Z₀, A, B, C, D, E는 각각 207.363, -0.01413, -1.4503, -2.32 × 10^-5, 0.00239, 1.70 × 10⁴이다. RGB 모델을 사용하여 2차 다항식 식으로 피 팅 한 결과 RGB 각각 R²이 0.9926, 0.9436, 0.1885이다. RZ의 시각적 인 색상은 푸른색으로 RGB 색상 분석에서는 푸른색은 투과하고 붉은 색과 녹색 계열의 색이 흡수되어 파란색은 농도 변화에 따른 색 변화 가 붉은색과 녹색에 비하여 적어 signal to noise 비율이 높아 상관관 계가 작은 것으로 보인다. RZ의 초기 농도를 알고 있다고 한다면 RGB 색상 좌표에서 R 또는 G를 사용하였을 때 RZ과 RF의 농도비를 구할 수 있으므로 각각의 농도를 구할 수 있다. 이것은 이성분계의 혼 합물의 농도는 전체 농도를 알고 있을 때 자유도가 1로 한 개의 색상 좌표로 농도를 구할 수 있다.

3.3. 고농도 RZ 환원 반응

Figure 3a는 RZ 환원 반응을 5 min마다 촬영한 디지털 이미지이다. 5 W 백색광 LED를 15 cm 거리에 둔 상태에서 카메라는 ISO 1/25, F 5.6, 조리개 최대 개방 5로 세팅하였다. 시간이 지날수록 붉은 색 계 열로 변화하는 것을 관찰하여 RZ가 RF로 환원되는 것을 알 수 있다. 이미지소프트웨어를 사용하여 200 × 200 픽셀 크기의 색상 좌표의 평 균 값을 추출하였다. 초기 RZ 농도 200 μM를 x로, 소프트웨어를 통해 추출한 색상 좌표 R값을 y로 하여 식 (1)에 대입하여 RZ의 비율을 얻 고 RZ와 RF의 농도를 계산하였다. Figure 3b는 초기 RZ 농도 200 μM 를 가지는 환원반응에서 색상 분석을 이용해 시간에 따른 RZ와 RF의 농도를 보여준다. RZ와 RF의 농도를 색상 좌표 R을 이용해 직접 구 할 수 있으며 다양한 반응 차수에 대한 선형화를 이용해 반응 속도를 구할 수 있다. Figure 3c는 색상 분석을 통해 분석한 RZ 환원 반응의 반응 속도 식을 선형화 한 그래프이다. 선형화한 데이터의 R²은 0.99로 이전 연구 결과[33]와 같이 2차 환원반응임을 확인할 수 있다. 0, 1, 3차에서는 R²이 0.99 미만으로 나왔다. 그래프의 기울기는 0.000067 이며 반응 속도 상수가 67 M^-1 min^-1이며, 촉매 질량 당 반응 속도 상 수는 3.53 mmol/min gcat이다.

색상 좌표를 이용한 고농도 시료의 농도 측정법의 유효성을 확인하 기 위해 자외선가시광선분광법으로 색상 좌표를 이용한 고농도 RZ의 환원 실험을 진행하였다. Figure 4a는 고농도의 RZ 환원 반응 용액의 일부를 희석한 후 자외선가시광선분광법 분석한 것이다. Figure 1에서 볼 수 있듯 RZ와 RF 약 50 μM 이상에서 자외선가시광선분광기를 이 용해 직접 분석이 어렵고 분석 동안의 추가적인 반응을 줄이기 위해 반응 용액을 약간 추출하여 20배 희석하여 반응 속도를 낮추고 자외 선가시광선분광기로 분석 가능한 농도 범위에서 분석하였다. 이전의 방법[33]으로 구한 농도에서 20배 높여 주여 희석 전의 농도를 계산하 였다. Figure4b는 2차 반응 속도 식을 선형화 한 결과로 색상 좌표를 이용한 방법과 동일하게 2차에서 가장 높은 R²가 얻어졌으며 이때의 기울기는 0.000069이다. RZ 환원 반응은 2차식이며 반응 속도 상수는 69 M^-1 min^-1이며 촉매 질량 당 반응 속도 상수는 3.53 mmol/min gcat 이다. RZ환원 반응은 색상 좌표를 이용한 분석과 희석을 통한 자외선 가시광선분광법 모두 2차 반응 속도가 가장 적합하게 나왔다. 반응 속 도 상수의 경우에는 자외선가시광선분광법을 이용한 경우가 색상 좌 표를 이용한 직접 분석법에 비해 약 3% 정도 높게 측정되었는데 이것 은 희석과 자외선가시광선분광기를 이용한 측정에서 시간이 흘러 용 액의 추출했을 때 보다 반응이 더 진행되어 높게 나온 것으로 판단된 다. 따라서 고농도에서의 직접 분석법에 비해 희석을 이용한 자외선 가시광선분광기를 이용한 방법은 오차가 발생할 수 있다.

4. 결 론

본 연구에서는 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 이성분계 시료의 농도와 색상 좌표 값 사이의 관계식을 통해 시간에 따라 변화하는 시 료의 농도를 측정하고 고농도에서 직접 측정을 할 수 있는 방법을 제 시하였다. RZ와 RF의 농도가 50 μM 한계를 초과하는 범위에서는 자 외선가시광선분광기를 이용할 때 비선형성과 superposition principle 적용이 어렵고 peak의 크기가 측정 한계를 넘는 문제가 발생하여 직 접 농도 측정이 불가능하다. 색상 분석을 이용할 경우 200~1000 μM 의 RZ와 RF의 농도에서 RZ + RF 농도, RZ 비율, 색상 좌표의 3가지 변수를 이용해 2차 다항식을 이용하면 자외선가시광선분광기의 농도 분석 한계를 극복할 수 있다. 더 나아가 고농도의 RZ 환원 반응에서 는 자외선가시광선분광기를 이용할 경우 시료의 희석, 이동, 분석을 하는 동안에 추가적인 반응이 진행될 수 있으나 색상 분석을 사용할 경우에는 직접 분석이 가능하여 반응 속도 상수를 더 정확히 측정할 수 있었다. 또한 이성분계 시료의 농도 측정에서는 전체 농도를 알 수 있는 경우 자유도가 1인 관계식을 얻을 수 있어 색상 좌표 하나로 간 단히 농도 측정이 가능하다. 이성분계 이상의 시료가 존재할 경우에 는 자유도가 시료의 개수에 따라 늘어나므로 복잡한 상관관계식이 사 용될 수 있다. 그리고 농도가 높아짐에 따라 명도가 낮아져 색상 분석 좌표의 해상도가 낮아질 수 있어 고농도에서는 높은 광원이 필요할 수 있다. 그럼에도 불구하고 색상 분석을 통한 농도 분석법은 기존의 액상 시료의 농도 측정 범위뿐만 아니라 측정 범위 이상의 고농도에 서도 희석 없이 직접 분석이 가능한 방법으로 UV, IR과 같은 다른 파 장 영역에 활용할 수 있다. 또한 다성분계의 시료의 경우 자유도를 고 려하여 시료의 농도 측정이 가능할 수 있다.