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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)

Applied Chemistry for Engineering Vol.34 No.1 pp.45-50
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2022.1128

Studies on Preconcentration and Electrophoretic Mobility of Fluorescent Dyes Depending on Flow Velocity and Concentration in the Electromembrane System

Minsung Kim^*, Bumjoo Kim^*,**†

^*Department of Future Convergence Engineering, Kongju National University, Cheonan 31080, Korea
^**Department of Mechanical & Automotive Engineering, Kongju National University, Cheonan 31080, Korea

^† Corresponding Author: Kongju National University, Department of Mechanical & Automotive Engineering, Cheonan 31080, Korea Tel: +82-41-521-9267 e-mail: bumjoo@kongju.ac.kr

Received December 22, 2022 ; Review January 4, 2023 ; Accepted January 5, 2022

Abstract

Microfluidic preconcentration technologies, which collect or extract low-abundance analytes in a specific location, have been spotlighted in various applications such as medical and bio-engineering. Here, we conducted extensive studies on the variables to be considered when concentrating target samples based on electrophoresis in an electromembrane system utilizing an ion exchange membrane. Using negatively charged Alexa Fluor 488 and positively charged Rhodamine 6G as fluorescent dyes, we examined the effects of flow velocity of the main channel, channel electrolyte concentration, and applied voltage on sample preconcentration. As a result, it was found that the preconcentration of the target sample occurs much better when the flow velocity is slow and the concentration of the main channel containing the sample is high, given that the channel concentration ratio (main and buffer) is constant. In addition, based on the experimental data acquired in this study, the electrophoretic mobility values of Alexa Fluor 488 and Rhodamine 6G were experimentally calculated and compared.

Key Words : Preconcentration , Electrophoresis , Ion exchange membrane , Fluorescent dye

전기막 시스템에서 유속과 농도에 따른 형광염료의 농축 및 전기영동 이동도에 관한 연구

김 민성^*, 김 범주^*,**†

^*공주대학교 미래융합공학과
^**공주대학교 기계자동차공학부

초록

마이크로 유체 시스템을 활용한 농축 기술은 저과다 분석물을 특정 위치에 모으거나 추출하는 기술로, 의료 및 바이 오 분야를 포함한 다양한 분야에서 필수적인 기술로 각광받고 있다. 본 연구에서는 이온교환막을 활용한 전기막 시스 템(electromembrane system)에서 전기영동(electrophoresis) 현상을 이용해 타겟 샘플을 농축할 때 고려해야 할 변수에 대한 광범위한 연구를 수행하였다. 가시화가 용이한 형광염료로 음전하를 띄는 Alexa Fluor 488과 양전하를 띄는 Rhodamine 6G을 샘플로 사용하여, 타겟 샘플이 포함된 메인 채널의 유속과 메인/버퍼 채널의 농도, 전압 등이 샘플 농축에 어떻게 영향을 끼치는지 알아보았다. 실험 결과, 메인/버퍼 채널 농도비가 같을 경우, 유속이 느릴수록, 샘플이 포함된 메인 채널의 농도가 높을수록, 타겟 샘플의 농축이 훨씬 더 잘 일어난다는 사실을 알 수 있었다. 또한 본 연구 를 통해 Alexa Fluor 488과 Rhodamine 6G의 전기영동 이동도 값을 실험적으로 계산하여 비교하였다.

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Funding:

1. 서 론

농축(preconcentration)이란 화학 물질에서 용매 등을 제거하여 주요 고체 성분의 농도를 높이는 공정으로, 주로 미세유체 시스템에서 활 발하게 연구되고 있다. 특히, 바이오 샘플을 다루는 랩온어칩(labon- a-chip, LOC) 디바이스에서 저과다 분석물(low-abundance analytes) 의 정밀한 조작과 검출을 위해서 샘플의 전처리를 위한 농축 기술의 개발은 필수적이라 할 수 있다[1]. 미세유체 시스템에서 농축 기술은 표면결합[2], 다공성 재료 여과[3], 등속전기영동법(isotachophoresis, ITP)[4,5], 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)[6,7] 등이 널리 알려 져 있는데, 최근에는 이온농도분극 현상(ion concentration polarization, ICP)[8]을 활용한 전기영동 기반의 미세유체칩에서 농축에 대한 연구 도 활발히 진행되고 있다.

이온교환물질의 표면에서 일어나는 이온농도분극 현상을 위해 초 창기에는 photolithography를 통해 직접 인공적인 나노 채널을 제작하 였지만[9], 이후에는 나피온(Nafion)과 같은 이온선택성을 가지는 폴 리머를 적용한 미세유체 농축기(microfluidic preconcentrator)가 개발 되었고 제작방법이 간단해지면서 더 많은 응용연구가 진행되었다 [10-13]. 정상 유동 기반의 전기막 농축기(electromembrane preconcentrator) 는 나피온 접점(junction) 근처에서 강하게 발생하는 정전기적 반발력, 전기장에 의한 전기영동(electrophoresis), 그리고 전체적인 외 부 유동 및 전기삼투 유동(external pressure driven or electroosmotic flow) 및 드래그(drag force)의 조합을 활용해 박테리아 및 각종 바이 오 샘플들을 분리/농축할 수 있음이 보고되었다[14-17].

최근에는 나피온 미세가공 대신 상용화된 이온교환막(ion exchange membrane, IEM)을 재단하여 유량을 증가시킨 전기막 농축기가 개발 되기 시작했다[18,19]. 3D 프린터로 polydimethylsiloxane (PDMS) 몰 드를 제작해 높은 종횡비(high aspect ratio)를 가지는 구조물 제작이 가능해 양이온교환막(cation exchange membrane, CEM)이나 음이온교 환막(anion exchange membrane, AEM)의 설치가 용이하고 기존의 SU8 기반의 microfluidic system에 비해 높은 유량을 인가할 수 있다 는 장점이 있다. 해당 플랫폼에서 농축 효율을 극대화하기 위해 CEM 2개와 그 사이에 얇은 다공성 막(porous membrane)으로 샘플 채널과 버퍼 채널을 분리시켜 위치한 ICP 농축 기술이 보고되었다[18]. 해당 논문에서 샘플 채널과 버퍼 채널을 비대칭으로 설계하고 채널 간의 유량 차이를 주어 형광 염료의 농축 효율을 향상시키기 위한 시도를 하였다. 또한, 본 연구진은 최근 3D 프린터로 제작한 몰드를 사용하여 PDMS 미세 유체 시스템을 제작하여 전기 영동 기반의 서브 마이크론 사이즈의 오일 방울(submicron-scale oil droplets) 농축에 대한 연구를 수행하였다[19]. 특히, 해당 연구에서는 전극에서 발생하는 각종 화학 생성물의 샘플과의 혼합을 막기 위해 메인 채널 위아래로 버퍼 채널 을 추가하여 전극 반응과 독립되어 안정적인 정상 유동 기반의 미세 오일 농축기를 개발하였다. 다만, 해당 연구에서 샘플에 인가되는 유속 과 샘플의 농축과의 상관관계에 대한 연구가 충분히 수행되지 않았다.

따라서, 본 연구에서는 전기막 시스템에서 유속에 따른 샘플의 농 축 계수(concentration factor)에 대해 실험을 통해 알아보았다. 형광 이 미지 가시화를 위해 음전하를 띄는 Alexa Fluor 488과 양전하를 띄는 Rhodamine 6G 두 종류의 형광 염료를 사용하였고 농축의 정도를 객 관화적으로 수치화하기 위해 농축 계수를 정의하였다. 각각의 샘플에 대해 농축 계수를 구하고 이를 통해 두 형광 염료의 평균적인 전기영 동 이동도(electrophoretic mobility)를 추정하였다.

2. 실 험

2.1. 이론

이온교환막은 이온을 선택적으로 투과시킬 수 있는 막으로 음이온 교환막(AEM)과 양이온교환막(CEM)이 있다. 이온교환막 양단에 전기 장이 인가되면 표면 전하의 극성에 따라 음이온교환막은 음이온만, 양이온교환막은 양이온만 선별적으로 통과시킨다. 본 연구에서는 Figure 1과 같이 두 개의 AEM과 CEM을 각각 교대로 배치시켜 위아 래 채널 벽면이 이온교환막으로 이루어진 총 세 개의 채널을 제작하 였다. 이 때, 가운데 채널에는 농축시킬 샘플을 전해질 수용액과 함께 주입하고 해당 채널을 메인 채널이라 부르기로 하고, 위아래 채널은 버퍼 채널로 정의하였다. 본 시스템에 전기장이 인가되면, 수용액 상 의 전하를 띈 입자들은 입자의 극성에 따라 특정 방향으로 상대적인 이동을 하는데 이를 전기영동이라 한다. 전기영동에 의한 입자의 속 도는 Smoluchowski 식에 의하여 다음과 같이 표현된다[20].

(1)

여기서 μ_ep 는 전기영동 이동도(electrophoretic mobility); E 는 전기장 세기; ε_r 과 ε_o 는 각각 상대/진공 유전율; ζ_p 는 입자의 제타 전위; η 는 수용액의 점도이다. 한편, 본 연구에서 이미지 분석을 통해 형광 농축이 얼마나 잘 일어나는지에 대한 지표로 농축 계수(Concentration Factor, CF)를 다음과 같이 정의하였다.

(2)

여기서 Recovery는 출구 채널 전체 폭 대비 농축 유동의 폭으로, 관련 정의나 계산법 모두 기존 연구[19]와 같은 방법으로 계산하였다. 다만, 농축이 얼마나 잘 일어나는지에 대한 직관적인 이해를 돕기 위해 본 연구에서는 농축 계수를 새롭게 정의했다. 예를 들어, 농축이 전혀 일 어나지 않았다면 CF 값은 1이고, 농축이 많이 일어난다면 이 값은 1 보다 커지게 된다.

2.2. 디바이스 제작 및 실험 방법

Figure 2a는 PDMS 기반의 마이크로 스케일 전기막 농축 디바이스 제작을 보여준다. 기존 연구에서 보고된 제작 방식대로, SU-8 기반의 포토리쏘그래피가 아닌, 3D 프린터(SLA ProJet 7000HD, 3D system, Rock Hill, PA, USA)로 PDMS 몰드를 제작하였다[19,21-23]. 이는 얇 은 두께의 마이크로 채널에 수직방향으로 상용화된 이온교환막과 전 극을 장착하기 위해서는 높은 종횡비를 가지는 몰드가 제작되어야 하 기 때문이다. 이렇게 제작된 위아래 PDMS 블록 사이에 두 개의 CEM/AEM (AMHPP/CMHPP; MEGA Inc. Hodonin, Czech Republic, USD 173/m2)과 전극(Spectracarb 2050A-1535; Fuel Cell Store, College Station, TX, USA)이 장착된 후, 플라즈마 처리를 거쳐 접합 하였다. 제작된 디바이스에 전기장을 인가하기 위해 양 전극에 전압 이 인가되었고, 메인 채널에 인가되는 유효 전압(V_eff, effective voltage) 을 측정하기 위해 Ag/AgCl 팁을 추가하였다.

Figure 2b는 전기막 농축 실험 셋업을 보여준다. 시린지 펌프 (Fusion 200-X; Chemyx Inc., Stafford, TX, USA)로 전단 유동(shear flow, 1 mm/s)이 인가된 상태에서, 전압을 인가하고 전류를 측정하기 위해 source measure unit (SMU, Keithley 2460; Keithley Instruments Inc, Cleveland, OH, USA)이 사용되었다. 전기영동의 주요 변수인 메 인 채널의 유효 전압만을 따로 측정하기 위해 멀티미터(34401A; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)를 추가로 사용하였 다. 이미지 프로세싱을 통한 농축 정도를 계산하기 위해 형광 현미경 (CKX 53; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 메인 채널 유동을 가시 화하였다. 메인 채널의 샘플은 sodium chloride 전해액(NaCl, 0.01/0.1 mM)에 두 가지 형광 염료 Alexa Fluor 488 (Alexa 488 triethylammonium; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)과 Rhodamine 6G (Bioreagent; Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA)를 각각 124 μM, 104 μM을 주입하였다. 버퍼 채널 용액의 경우, 형광 염료 없이 sodium chloride 전해액(NaCl, 1/10 mM)만을 사용하였는데, 항상 메인 채널의 농도의 100배가 되게 하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 형광염료 농축 가시화

먼저 유속 변화에 따른 형광 염료의 농축을 관찰하기 위해 유동 가 시화를 진행하였다. 본 가시화 실험에서 메인 채널의 전해질 농도는 NaCl 0.1 mM, 버퍼 채널은 10 mM로 고정하였다. 이때 인가 전압은 6 V와 12 V 두 개로 고정하였다. Figure 3에서 전단 흐름(shear flow) 으로 인가된 형광 염료 샘플이 좌측에서 우측으로 이동하면서 위아래 방향인 전기장에 의해 점점 농축이 되는 것을 알 수 있다. Figure 3a는 형광 염료 Alexa Fluor 488에 유동 가시화 사진이고, Figure 3b는 형광 염료 Rhodamine 6G에 유동 가시화 사진이다. 이 때, 형광 염료의 극 성에 따라 음전하를 띄는 Alexa Fluor 488은 양극면(anodic side)인 CEM 쪽으로 농축되고, 반대로 양전하를 띄는 Rhodamine 6G는 음극 면(cathodic side)인 AEM 쪽으로 농축이 되는 것을 확인할 수 있다. 또한 전압이 증가할수록 메인 채널에 인가되는 전기장 역시 증가하므 로 농축이 더 잘 일어나는 것이 관찰된다. 특히, 유속의 경우, 벌크 유 동의 속도가 느릴수록 입자가 채널에 머무르는 시간(residence time)이 길어져 전기영동에 의한 힘을 더 오래 받아 농축이 더 잘되는 것으로 추정할 수 있다.

3.2. 농축계수 비교

Figure 3에서 관찰한 형광 염료의 농축 현상을 이미지 프로세싱을 통해 전압 및 유속 조건 별 농축 계수를 수치화하여 비교해보았다. 추 가로, Figure 3의 실험 조건 외에 메인 채널과 버퍼 채널의 전해질 농 도를 각 0.01 mM, 1 mM로 낮춘 경우도 조사하였다. 마찬가지로 인가 전압 또한 6 V와 12 V로 고정하였다. Figure 4에서 우리는 세 가지 현상을 관찰할 수 있다. 첫 번째로, 앞선 가시화 이미지에서 확인한 대로, 전압이 증가하거나, 유속이 느릴수록 농축계수가 커지는 것을 객관적인 수치로 확인할 수 있다. 두 번째로, Alexa Fluor 488이 Rhodamine 6G보다 동일한 조건(전해질 농도, 전압, 유속 등)에서 농 축 계수가 더 큰 것을 확인할 수 있다. 이는 기존에 보고된 연구 결과 와도 일치하는데[24] Alexa Fluor 488의 전기영동 이동도가 기본적으 로 Rhodamine 6G에 비해 2배 이상 높기 때문이다. 마지막으로, 전해 질 농도가 높은 경우 농축이 더 잘 일어나는 것을 확인할 수 있다. 전 해질 농도가 샘플의 전기영동 이동도에 영향을 끼치기는 하지만[25] 메인 채널과 버퍼 채널의 전해질 농도에 따라 메인 채널에 걸리는 유 효 전압(V_eff = E)이 달라질 수 있기 때문에 이에 대한 좀 더 면밀한 검토가 필요하다.

3.3. 전기영동 이동도 계산

Figure 4에서 확인한 전해질 농도와 농축 계수와의 상관관계를 좀 더 알아보기 위해 형광 염료와 같이 전하를 띄는 입자가 전해질 수용 액에서 받는 힘(전기영동 포함)을 분석하고 이에 따라 농축 계수에 영 향을 준 인자가 전기영동 이동도인지, 아니면 유효 전압인지를 확인 하고자 한다. Figure 5는 형광 염료가 농축되는 메커니즘을 표시한 것 으로 외부압력에 의한 전단 방향의 유속(v_p), 전기영동에 의한 수직 방 향의 유속(v_ep)으로 입자의 이동 궤적을 표시했다. 최하단에 있는 입자 가 농축 스트림까지 도달한다고 가정하고 이 때의 농축 스트림의 두 께 d_con과 회수 스트림의 두께 d_rec를 실제 가시화 실험에서 구한 농축 계수(CF)로 계산하였다. 유효 전압(V_eff = E)의 경우 Ag/AgCl 전극으 로 측정한 값을 사용하였고 입자의 이동으로 인한 드래그나 농축으로 인한 입자 간 반발은 계산 편의상 무시하였다. Table 1-a와 1-b에서 각 각 Alexa Fluor 488와 Rhodamine 6G의 실험데이터를 정리하였다. 해 당 표에서 유효 전압의 경우 메인 채널이 0.01 mM인 경우가 0.1 mM 인 경우보다 전체적으로 더 낮게 측정된 것을 확인할 수 있다. 그 이 유는 메인 채널과 버퍼 채널의 농도비 뿐 아니라 버퍼 채널 자체의 전해질 농도가 높을수록 메인 채널에 더 많은 유효 전압이 인가되는 것으로 판단할 수 있다. 다시 말해, 버퍼 채널의 절대 농도가 높을수 록 용액의 큰 전도성과 활발한 전달 현상으로 인해 이온교환막 계면 의 전기적인 저항이 더 많이 감소하기 때문으로 보인다. 따라서 Figure 4에서 관찰한 메인 채널 농도에 따른 농축 계수의 차이는 입자 의 전기영동 이동도가 아닌 메인 채널에 걸리는 유효 전압의 차이 때 문인 것으로 추정할 수 있다. 이를 뒷받침하기 위해 우리는 실험을 통 해 도출된 Alexa Fluor 488과 Rhodamine 6G의 전기영동 이동도(μ_ep) 를 모두 계산하여 Figure 6에 표시해보았다. 본 실험에서 전해질 농도 가 0.01 mM일 때, Alexa Fluor 488의 전기영동 이동도는 10.46 × 10^-9 m² / V⋅s에서 43.81 × 10^-9 m² / V⋅s로 Rhodamine 6G의 이동도(7.81 × 10^-9 m² / V⋅s~17.08 × 10^-9 m² / V⋅s)보다 1.920배 높은 것으로 확인 되었다. 또한 전해질 농도가 0.1 mM일 때는 1.921배로 0.01 mM일 때 와 비교해서 비슷한 것으로 확인되었고, 이는 비록 전해질 수용액의 종류는 다르지만, Alexa Fluor 488이 Rhodamine 6G보다 2배 이상 높 은 전기영동 이동도를 가진다는 선행 연구[24]와 어느 정도 일치한다.

4. 결 론

우리는 본 연구에서 널리 알려진 형광 염료인, 음전하를 띄는 Alexa Fluor 488과 양전하를 띄는 Rhodamine 6G에 대해 전기영동 기반의 농축 실험을 수행하였다. 이를 위해 이온교환막으로 이루어진 마이크 로 스케일 전기막 농축기를 제작하고 형광 염료가 포함된 메인 채널 과 형광 염료가 포함되지 않는 버퍼 채널의 농도를 다양하게 바꿔가 면서 유속에 따른 타겟 샘플의 농축 현상에 대해 알아보았다. 본 연구 를 통해 우리는 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 첫째, 샘플의 유 속이 느릴수록 입자가 채널에 머무르는 시간이 길어져 농축이 더 잘 일어난다. 둘째, 채널 농도비가 같을 때, 메인 채널의 농도가 높을수 록, 형광 염료의 농축이 더 잘 일어난다. 이는 버퍼 채널의 절대적인 농도가 높을수록 메인 채널에 더 많은 유효 전압이 걸리기 때문이다. 마지막으로, Alexa Fluor 488의 경우 Rhodamine 6G보다 평균적으로 1.921배 정도 높은 전기영동 이동도를 가진다. 따라서 이와 같은 농축 계수와 관련된 다양한 조건들에 대한 연구를 기반으로, 전기막 마이 크로유체 농축기를 통한 효과적인 바이오 샘플 응용을 기대할 수 있 을 것이다.

감 사

본 논문은 2022년도 정부(과학기술정보통신부, 교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 개인기초연구(No. 2020R1F1A1 075999)와 지자체-대학협력기반 지역혁신 사업(2021RIS-004)의 결과임.

Figures

Figure 1.

Scheme of microfluidic electromembrane preconcentrator under DC electric field.

Figure 2.

(a) Fabrication of PDMS-based microscale electromembrane preconcentrator and (b) experimental setup.

Figure 3.

Fluorescent images of (a) Alexa Fluor 488 and (b) Rhodamine 6G preconcentration for different flow velocity (0.5-3 mm/s) and voltages (6, 12 V).

Figure 4.

Comparison of concentration factor of (a) Alexa Fluor 488 and (b) Rhodamine 6G. Green (low concentration) and brown (high concentration) indicate main 0.01 mM / buffer 1 mM and main 0.1 mM / buffer 10 mM NaCl electrolyte solution, respectively.

Figure 5.

Scheme of fluorescent dye preconcentration by electrophoresis.

Figure 6.

Calculation of electrophoretic mobility of Alexa Fluor 488 and Rhodamine 6G.

Tables

Table 1a.

List of Parameters of Alexa Fluor 488 for Preconcentration. Low and High Concentration Indicate Main 0.01 mM / Buffer 1 mM and Main 0.1 mM / Buffer 10 mM NaCl Electrolyte Solution, Respectively

Table 1b.

List of Parameters of Rhodamine 6G for Preconcentration. Low and High Concentration Indicate Main 0.01 mM / Buffer 1 mM and Main 0.1 mM / Buffer 10 mM NaCl Electrolyte Solution, Respectively

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