1. 서 론
최근 라섹(LASEK, laser epithelial keratomileusis), 라식(LASIK, laser-assited in situ keratomileusis), 스마일 라식(SMILE, small incision lenticule extraction) 등 다양한 눈 시력 교정 수술들과 다양한 눈 관련 질병(백내장, 녹내장 및 안구건조증)의 환자 수 및 의료비가 증가함에 따라서 눈의 건강 및 관리에 대한 관심이 매우 높아지고 있다[1-3]. 일 반적으로 시각을 담당하는 신체 부위인 눈은 사람들이 매우 중요하게 생각하는 감각이다. 눈은 인간이 처리하는 감각 정보들의 약 80%를 차지하는 중요한 시각 감각이다[4-5]. 눈의 건강상태 및 질병 유무를 확인하기 위해서는 일반적으로 병원에 방문하여 이학적 및 전문 장비 를 통해 눈물막, 시신경, 황반부, 각막, 수정체 등을 검사한다. 하지만, 기존 검사들은 직접 병원에 방문해야 하는 번거로움, 오랜 진단 시간, 저렴하지 않은 검사 비용 등 단점들이 존재한다[6]. 눈물은 눈에서 나 오는 체액으로 눈의 건강 상태와 관련된 정보들을 많이 포함하고 있 다[7]. 이로 인해 최근 인간의 몸 안에 존재하는 바이오마커인 눈물의 포도당, 단백질, 이온, pH 등을 측정하여 눈의 건강상태를 쉽고 빠르 게 확인하는 많은 연구들이 진행되고 있다[8-11]. 예를 들어 눈물의 포도당 측정을 통해 당뇨병에 대한 정보, 눈물의 단백질 측정은 당뇨 망막병증에 대한 정보를 알 수 있으며, 눈물의 펩신 측정은 후두인두 역류병(위액이 식도를 넘어 역류하는 것)에 대한 정보를 알 수 있다 [12-14].
현대에 들어서면서 스마트폰 및 컴퓨터 사용, 시력 교정수술, 환경 오염, 노화 등으로 인해 안구건조증 환자 수는 해마다 증가하고 있다 [15-19]. 하지만 이를 인지하고 병원에 가서 치료를 받게 되면 많은 돈 과 시간이 소모될 뿐만 아니라 이미 늦은 상태일 수도 있다. 따라서 미리 자신의 눈 건강 생태를 파악하고 있다면 이는 금전적, 시간적으 로나 눈 건강에 큰 도움이 될 것이다. 안구건조증을 확인하기 위한 방 법으로 눈물양 검사(Schirmer test), 눈물막 파괴 시간 검사(tear break-up time, TBUT), 생체 염색 등의 방법들이 보고되었지만 이러한 기존의 방법들은 검사 결과의 정밀성 및 재현성이 좋지 않다는 점, 거부감이 있는 침습적인 방법, 염색을 해야 한다는 번거로움, 안구에 손상이 간 다는 점 등 검사의 한계들이 보고되면서[20-22] 최근에는 전도도 측정 을 통해 삼투압을 확인하는 연구가 많은 관심을 받고 있다. 눈물의 삼 투압은 안구건조증으로 인해 상승하며 정상적인 눈의 삼투압은 300 mOsms/L, 300~320 mOsms/L는 경도의 건조증, 320~340 mOsms/L는 중등도 건조증, 심한 경우 340 mOsms/L 이상으로 측정된다고 보고되 기 때문에 일반인들이 자신의 안구건조증을 판단하는 데 어려움이 없 다. 또한 비침습적인 방법으로 환자들의 거부감도 덜하며 검사의 정 밀성 및 재현성부분에 있어서 우수하다[21,23-25]. 상용화된 눈물 측 정용 삼투압 센서는 전기화학 방식에 기반을 두고 있다. 이러한 센서 는 간단하면서도 빠른 측정이 가능하여 병원에서 환자의 안구건조증 유무를 진단하는 장치로 널리 사용되고 있다[23,26]. 하지만, 2상 전극 을 기반으로 전기화학 측정 방식은 고체의 전극과 액상의 눈물이 계 면에서 반응할 때 분극(polarization) 현상을 발생시켜 불안정한 전기 화학적 신호를 야기시킨다.
본 논문에서는 용액의 이온 농도 측정이 가능한 2상 금 전극의 임 피던스(impedance) 센서를 개발하였다. 스퍼터링(sputtering) 공정을 통해서 제작된 금 전극의 표면을 나피온 폴리머(Nafion polymer)를 사 용하여 표면 개질 하였다. 상기 제작된 전극은 분극 현상 제어가 가능 하여 전기화학적 신호를 안정적으로 측정할 수 있도록 하였다. 전자 주사현미경 관찰을 통하여 나피온 폴리머가 얇게 코팅되었음을 확인 하였다. 나피온 코팅이 된 전극은 기존 금 전극에 비해 안정적인 임피 던스 신호를 보여 주었으며, 표준 염화나트륨(NaCl) 용액 사용 시 임 피던스 센서의 신뢰성 높은 검정 곡선(R2 = 0.983)을 나타내었다. 또 한, 임피던스 센서는 상용화 제품인 Horiba 전도도 장치와 인공 눈물 의 이온 농도 측정 비교 실험을 진행하였으며, 유사한 결과치를 보임 을 확인하였다.
2. 실 험
2.1. 재료
센서 제작 및 성능 평가를 위해 Nafion® perfluorinated resin solution (5 wt%)과 Sodium chloride는 SIGMA-ALDAICH (미국)사의 제 품을 구매하였다. Real sample 측정을 위해 New V.Rohto Ex 점안액 과 Rohto Aqua 점안액은 ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd. (한국)의 제품을 구매하였다. Frenz eye drop 점안액은 JW Pharmaceutical (한국) 의 제품을 구매하였다. Orion Application Solution (12.9 mS/cm)은 Therom SCIENTIFIC (미국)사의 제품을 구매하였다. 전도도 측정 장 치인 Laquatwin-EC-33은 Horiba (일본)의 제품을 구매하였다. 증류수 (18.2 MΩ cm)는 Barnstead International (미국)사의 제품을 통해 증류 되었다.
2.2. 금 전극 제작 및 표면 개질
센서는 유연 printed circuit board (PCB) 기판을 이용하여 제작하였 으며, PCB 기판의 구리를 에칭(etching)하여 디자인된 전극 모양으로 제작한 후 높이 100 nm로 도금 방법을 이용하여 금전극을 제작하였 다. 총 2개의 전극으로 구성되어 있으며, 전극의 크기는 가로 1.8 mm 와 세로 1.3 mm로 구성하였으며, 도금 이후 전극의 보호를 위하여 에 폭시(epoxy)를 스크린 프린팅으로 코팅하여 사용하였다. 전극의 측정 부위에 각각 앞면과 뒷면에 나피온 2 μL를 도포한 후 90 °C에서 2시 간 동안 오븐에 넣고 건조를 진행한다.
2.3. 실험 방법
광학현미경(optical Microscope, OM) 이미지는 Olympus사의 Optical microscope-BX53MTRF-s를 사용하여 얻어졌다. 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM) 이미지는 Hitachi사의 S-4800을 사용하여 얻어졌다. 센서 성능 평가를 위한 전기화학실험은 Ametek사의 VersaSTAT4를 사용하여 진행되었으며 real sample 측정을 통한 Horiba 전도도 장치와의 비교를 할 때에는 Horiba 전도도 장치와 동일 한 인쇄 회로 기판 보드(printed circuit board, PCB)를 사용하여 진행 되었다. 임피던스 측정 실험은 실온, 100 Hz, 50 Amp 조건 하에서 진 행되었으며 염화나트륨 용액 100~200 mM 범위 내에서 이루어졌다. 실험에 사용된 염화나트륨 용액은 200 mM 용액을 제작한 후 증류수 를 추가하여 100, 125, 150, 175 mM 용액을 제조하였다.
3. 결과 및 토의
임피던스 금 전극의 나피온 폴리머 표면 개질과 이의 전기화학적 성능 평가 실험에 대한 모식도를 Figure 1(a)에 나타내었다. 나피온 코 팅 금 센서(Nafion-coated Au sensor, NAS)는 Nafion® perfluorinated resin solution (5 wt%) 2 μL를 제작한 금 전극의 앞면과 뒷면에 각각 도포한 후 90 °C에서 2시간 건조를 통해 제작되었다. 그 후 전기화학 장비인 VersaSTAT4를 사용하여 센서의 성능 평가 및 인공눈물 점안 액 측정을 진행하였다. 나피온 폴리머 코팅을 통한 전극 표면의 변화 를 알아보기 위하여 광학현미경과 전자주사현미경을 이용하여 표면 을 관찰하였다(Figure 1b-e). 스퍼터링 방법으로 제조된 금 전극의 표 면은 매끄럽지 못하며 많은 grain을 포함하고 있음을 확인하였다. 이 러한 표면 결함들은 용액 샘플 측정 시 분극 현상을 유도하여 임피던 스 측정 신호를 불안하게 하는 주요 요인이 된다. 나피온 폴리머의 표 면 개질은 금 전극의 전체적인 표면을 보다 매끄럽게 만들어주었으며, micro-grain들이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.
NAS의 표면 개질 효과를 확인하기 위해 bare 금 전극 기반의 센서 (Au-based sensor, AS)와 NAS 두 개의 센서에 대한 전기화학적 비교 실험을 진행하였다. Figure 2a는 고상 형태의 센서에 대한 임피던스와 저항 값의 시간에 따른 신호 변화를 보여주고 있다. 고상에서의 NAS 와 AS는 나피온 폴리머 코팅을 진행하여도 각각의 값이 큰 차이 없이 거의 일치하는 모습을 보여준다. 센서는 기본적으로 두 개의 금 전극 으로 구성되어 있다. 이에 센서 내에서 각각의 전극을 측정한 경우에 도 고상에서의 측정 시에는 전극 간 편차가 적음을 알 수 있다. 마찬 가지로, 나피온 폴리머가 코팅된 NAS도 두 개의 전극 값이 거의 유사 함을 알 수 있다. 이는 나피온 폴리머가 금 전극 표면에 고르게 코팅 되었음을 의미한다. Figure 2b는 염화나트륨 용액(150 mM)에 센서를 담지한 후 임피던스를 측정한 값이다. Bare AS의 경우 시간에 따른 임피던스 값 신호가 급격히 증가함을 알 수 있다. 이는 금 전극이 용 액에 담지된 후 임피던스 측정을 위해서 인가된 저전류에 의해 분극 현상이나 정전효과, 즉 용량성 효과가 유도되었기 때문이다. 이에 반 해, NAS는 표면 개질된 나피온 막에 의해서 분극 현상이 잘 제어 됨 을 확인하였다. 초기에 측정된 임피던스 값이 시간에 따라서 일정하 게 유지됨을 알 수 있다. 또한, 임피던스 값이 떨어졌다는 것은 저항 값이 떨어졌다는 뜻이기 때문에 전도도가 향상되었다고 볼 수 있다. 즉 나피온 코팅을 통해 분극 현상으로 인한 측정 값의 변화를 없애고 전도도 향상 효과를 얻을 수 있었다.
임피던스 측정이 가능한 2상 전극 기반의 센서는 전해질 용액의 농 도에 따른 전도도 또는 저항 변화 측정이 가능하다. 반트 호프의 삼투 압 방정식(Van't Hoff equation)을 통해서는 용액의 삼투압 측정 또한 가능하다[27]. Figure 3은 NAS와 AS를 이용하여 여러 농도의 염화나 트륨 (100~200 mM) 용액에 담지한 후 측정된 임피던스 값들과 농도 의 검정 곡선을 나타낸다. 먼저 동일한 주파수(100 Hz)에서 얻은 검정 곡선을 비교하였다(Figure 3a). Bare AS는 -5.28 Ω mM-1 (R2 = 0.977) 의 센서 민감도를 나타내었고, NAS는 -8.98 Ω mM-1 (R2 = 0.983)의 성능을 보여주었다. 나피온 폴리머의 표면 개질을 통해 민감도의 경 우 70%가 향상 되었으며, 결정계수 (coefficient of determination) 또한 향상되었음을 확인하였다. 보다 안정적인 NAS의 임피던스 신호 측정 을 위하여 여러 주파수 영역(0.1, 1, 10 kHz)에서 염화나트륨 농도에 따른 임피던스 변화를 측정하여 비교해보았다. Figure 3b에 도시된 검 정곡선을 살펴보면, 0.1 kHz에서는 -8.98 Ω mM-1 (R2 = 0.983), 1 kHz 에서는 -0.76 Ω mM-1 (R2 = 0.980), 10 kHz에서는 -1.02 Ω mM-1 (R2 = 0.969)의 값을 나타내었다. 0.1 kHz에서의 측정된 민감도 값이 제일 우수하다는 것을 알 수 있다.
나피온 폴리머 코팅으로 인한 금 전극 표면의 전기화학적 변화를 관찰하기 위하여 전기화학 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy)으로 NAS와 AS의 전극 변화 실험을 수행하였다. Figure 4a는 센서의 Bode plot으로 주파수에 따른 임피던스 크기와 위상 변화 를 확인할 수 있는 그래프이다. Figure 4b는 Nyquist plot으로 임피던 스의 실수부와 허수부로 분리하여 표현한 그래프이다. Bare AS에 비 해서 NAS는 임피던스 값과 위상 값 모두 낮은 것을 알 수 있으며, 임 피던스 허수 값 또한 낮아짐을 확인할 수 있다. 이는 금 전극의 나피 온 폴리머 코팅으로 인해 전극의 분극 현상과 정전 용량 효과가 떨어 지게 되면서 용량성 효과가 떨어짐에 따른 것이다.
NAS의 전기화학적 성능을 검증한 후, 눈물의 삼투압 측정이 가능 한 센서 분야로의 응용 가치를 증명하는 실험을 수행하였다. 이는 눈 물과 유사한 인공눈물 샘플을 이용하여 용액의 전도도(conductivity) 측정 실험을 진행하였다. Figure 5a는 실제 측정한 샘플의 사진이며 왼쪽부터 전도도 용액(Therom Scientific), 인공눈물 1 (ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.), 인공눈물 2 (ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.), 인공눈물 3 (JW Pharmaceutical)이다. 센서의 성능을 검증하기 위하여 상용화된 Horiba 제품과 비교 실험하였다. Figure 5b는 염화나 트륨 용액 100~200 mM에서 Horiba 센서와 NAS의 검정곡선이다. 동 일한 조건에서 측정하기 위해 NAS는 Horiba 센서와 동일한 인쇄 회 로 기판을 사용하여 측정하였다. 측정 결과 Horiba 센서는 R2 = 0.999, NAS는 R2 = 0.998로 NAS의 결정계수는 Horiba 센서와 거의 차이를 보이지 않았다. 전도도 민감도의 경우 NAS는 0.043 mS cm-1 mM-1로 Horiba 센서의 민감도(1.103 mS cm-1 mM-1)와 차이를 보였다. 하지만, 전도도는 임피던스의 역수로 표현되는 값으로 임피던스 값을 사용하 면 NAS가 더 높은 민감도를 보이게 된다. 이에 실제 인공눈물 샘플을 사용하여 측정된 이온 농도값을 비교하였다. Figure 5c는 Figure 5b 검 정곡선을 기반으로 인공눈물 샘플의 전도도를 측정하여 농도값을 얻 어 비교한 그래프이다. 그래프에서 Solution은 전도도(12.9 mS/cm) 용 액이어서 Horiba 센서와 NAS센서의 기준으로 사용할 수 있다. 전도 도 용액과 인공눈물 샘플 3가지를 측정 및 비교하였을 때, 각각 Solution의 농도는 86.64 mM과 93.29 mM, Artificial tears 1의 농도는 55.18 mM과 67.89 mM, Artificial tears 2의 농도는 63.56 mM과 71.62, Artificial tears 3의 농도는 80.60 mM과 85.14 mM로 두 센서의 차이는 최소 4.54 mM에서 최대 12 mM 차이로 큰 차이가 없었다. 또 한 계산된 농도의 경향성이 유사한 것으로 보아 민감도의 차이가 있 어도 결정계수가 거의 일치하므로 NAS로 용액의 전도도 측정에 사용 가능함을 확인할 수 있었다.
4. 결 론
본 논문에서는 금 전극에 나피온 폴리머로 표면 개질함으로써 전기 화학적 임피던스 측정 시 안정적인 신호 검출이 가능함을 증명하였다. 나피온 폴리머의 박막 코팅은 기존 스퍼터링 방식을 통해서 제조된 금 전극의 표면 결함을 보완하여 고/액 계면에서의 분극 현상을 줄 일 수 있었다. 최적화된 주파수는 100 Hz로 NAS는 대조군 AS와 비교하 여 우수한 -8.98 Ω mM-1 (R2 = 0.983) 민감도 값을 보여주었다. 전기 화학 임피던스 분광학 분석법을 이용하여 나피온 폴리머 표면 개질에 따른 전극의 변화를 관찰하였다. 또한, 눈물과 유사한 인공 눈물 샘플 측정 실험을 상용화된 Horiba 센서와 비교실험을 진행하였다. NAS는 상용 제품 대비 인공눈물의 전도도 측정에 대한 유사한 성능을 보여 주었다. 나피온 폴리머 코팅의 재현성 및 양산성 등 더 검증해야 할 부분이 존재하지만 제작 공정이 매우 간단하고 임피던스 측정 시 분 극 현상을 효과적으로 방지한다는 점에서 다양한 전기화학 센서로의 응용 가능성이 높다고 판단된다.
