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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)

Applied Chemistry for Engineering Vol.33 No.1 pp.17-27
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2022.1003

Inorganic Nanoparticles for Near-infrared-II Fluorescence Imaging

Yong Il Park†

School of Chemical Engineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Republic of Korea

^† Corresponding Author: Chonnam National University School of Chemical Engineering, Gwangju 61186, Republic of Korea Tel: +82-62-530-1886 e-mail: ypark@jnu.ac.kr

Received January 5, 2022 ; Review January 14, 2022 ; Accepted January 17, 2022

Abstract

Fluorescence imaging is widely used to image cells or small animals due to its high temporal and spatial resolution. Because conventional fluorescence imaging uses visible light, the penetration depth of light within the tissue is low, phototoxicity may occur due to visible light, and the detection sensitivity is lowered due to interference by background autofluorescence. In order to overcome this limitation, long-wavelength light should be used, and fluorescence imaging using near-infrared-I (NIR-I) in the region of 700~900 nm has been developed. To further improve imaging quality, researchers are interested in using a longer wavelength light, near-infrared-II (NIR-II) ranging from 1000 to 1700 nm. In the NIR-II region, light scattering is further minimized, and the penetration depth of light in the tissue is improved up to about 10 mm, and autofluorescence of the tissue is reduced, enabling high sensitivity and resolution fluorescence imaging. In this review, among various NIR-II fluorescence imaging probes, inorganic nanoparticle-based probes with excellent photostability and easily tunable emission wavelength were described, focusing on single-walled carbon nanotubes, quantum dots, and lanthanide nanoparticles.

Key Words : Near-infrared-II , Short-wave infrared , Fluorescence , Imaging , Nanoparticles

근적외선-II 형광 이미징을 위한 무기 나노입자

박 용일†

전남대학교 화학공학부

초록

형광 이미징은 시간 분해능과 공간 해상도가 높기 때문에 기초연구에서 세포나 소동물 이미징에 널리 활용된다. 기존 의 형광 이미징은 가시광선 영역의 광원을 활용하기 때문에 조직 내 광투과도가 낮고, 광원에 의한 광독성이 생길 수 있으며, 자가형광에 의한 간섭으로 검출 민감도가 떨어지는 한계가 있다. 이러한 점을 개선하기 위해 에너지가 낮은 장파장의 광원을 활용하고자 하며, 700~900 nm 영역을 활용하는 근적외선-I 형광 이미징이 개발되었고, 이미징 성능을 대폭 향상시키기 위해서 1000~1700 nm 영역의 장파장을 이용하는 근적외선-II 이미징이 연구자들의 관심을 받고 있다. 근적외선-II 영역은 광산란이 최소화되어 생체조직 내 투과도를 약 10 mm까지 향상시킬 수 있고, 생체조직 의 자가형광도 최소화되어 고민감도와 고해상도의 형광 이미징이 가능하다. 본 총설에서는 다양한 근적외선-II 형광 이미징 탐침 중에서 광안정성이 뛰어나고 발광 파장 조절이 용이한 무기 나노입자 기반 탐침에 대해 살펴보았고, 그 중에서 단층 탄소 나노튜브와 양자점 및 란탄족 나노입자에 대해 중점적으로 기술하였다.

키워드 :

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1. 서 론

생물학적인 구조와 현상을 관찰하기 위해 다양한 생체 이미징 기술 이 개발되어 활용되고 있다. 그리고 표적 분자나 병변을 선택적으로 관찰하거나 이미징 신호를 증폭하기 위해 다양한 이미징 탐침이 함께 개발되고 있다. 또한, 나노기술의 발전은 기존의 유기 분자나 금속-유 기화합물보다 성능이 뛰어나거나 독특한 물리적 및 화학적 특성을 가 지는 무기 나노입자 기반의 이미징 탐침의 개발도 가능하게 한다[1]. 예를 들면, 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)는 기존 Gd³⁺ 기반 T1 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제보다 검출 민감도가 월등히 향상된 T2 MRI 조영제로서 가능성 을 보여주었고, 금 나노입자(gold nanoparticles)나 산화 탄탈륨 나노입 자(tantalum oxide nanoparticles)는 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography, CT)의 조영제로서 가능성이 보고되었다. 양자점(quantum dots, QDs)은 형광염료에 비해 광학적 안정성이 뛰어나고 발광 파장의 조 절이 자유로운 장점 때문에 형광 이미징 탐침으로 각광을 받았으나, 자외선(ultraviolet, UV) 광원에 의한 광독성 부작용과 양자점의 구성 원소인 중금속의 잠재적인 독성 및 가시광선의 낮은 생체조직 내 투 과도 등으로 임상에 적용하기에는 한계가 존재한다.

형광 이미징은 광원의 생체조직 내 투과도가 낮기 때문에 MRI나 CT처럼 임상에서 활용되는데 한계가 있지만, MRI나 CT에 비해 시간 분해능과 공간 해상도가 높기 때문에 소동물 이미징에서 여전히 많은 장점을 갖는다. 예를 들어, 새로운 치료제를 개발할 때 세포 실험뿐만 아니라 마우스 실험을 통해 치료제의 생체 내 약동학/약력학 등을 연 구하는데 형광 이미징이 널리 사용된다. 하지만, 기존의 형광 이미징 은 가시광선 영역의 광원을 활용하기 때문에 광원에 의한 광독성 부 작용이 생길 수 있고, 생체물질의 자가형광(autofluorescence)에 의한 배경 신호의 간섭과 이에 따른 낮은 신호 대 배경 비율(signal-to-noise ratio, SNR 또는 signal-to-background ratio, SBR)로 검출 민감도가 떨 어지는 단점이 존재한다. 그리고 가시광선 광원은 생체 내 투과도가 낮기 때문에 마우스의 혈관을 관찰하기 위해서는 생체현미경 (intravital microscopy)을 이용하며, 이를 위해 침습적인 방법으로 마 우스의 피부나 두개골에 생체 삽입형 윈도우를 설치해야 한다. 이러 한 기존 형광 이미징의 단점을 개선하기 위해서 가시광선(400~700 nm)보다 장파장인 근적외선(near-infrared, NIR, 700~1700 nm) 영역을 활용하는 이미징 기법이 최근 활발하게 연구되고 있다[Figure 1(a)] [2-5]. 근적외선은 가시광선보다 광자의 에너지가 작기 때문에 생체물 질에 의한 흡수나 산란이 훨씬 적어서 광원의 투과도가 증가하고 자 가형광은 크게 감소하여 검출 민감도가 증가한다[Figure 1(b)]. 즉, 생 체 삽입형 윈도우를 설치하지 않고 비침습적인 방식으로 기존보다 더 깊숙한 생체 내부를 더 높은 민감도로 관찰할 수 있다.

근적외선 영역은 파장에 따라 700~900 nm의 근적외선-I(NIR-I)과 1000~1700 nm의 근적외선-II(NIR-II)로 구분되며, NIR-II는 단파장 적 외선(short-wave infrared, SWIR)이라고도 불린다. NIR-I 영역을 이용 하는 형광 이미징은 indocyanine green(ICG)와 같은 형광염료뿐만 아 니라 양자점과 같은 무기 나노입자 기반 이미징 탐침이 많이 개발되 었고, 이와 함께 이미징 시스템도 개발되었다[6]. 하지만 기존 가시광 선 영역에 비해 성능이 향상되었음에도 0.2 mm 정도의 얕은 투과 깊 이와 마이크로미터 수준의 해상도는 여전히 폭넓은 활용에 한계로 작 용한다. 따라서, 많은 연구자들은 NIR-I보다 장파장인 NIR-II 영역의 활용에 관심을 갖게 되었고, 더 낮은 생체물질에 의한 자가형광으로 더 높은 검출 민감도를 구현할 수 있고, 광산란도 더욱 줄어서 1~3 mm 깊이까지 투과할 수 있음이 보고되었다. 또한, NIR-II 영역도 1300~1400 nm의 NIR-IIa와 1500~1700 nm의 NIR-IIb 영역으로 세분 화되며[Figure 1(a), Figure 2(a)], NIR-IIb 영역에서 형광 신호가 방출 될 때 자가형광이 더 감소하여 더 높은 SNR이 달성될 수 있음이 보고 되었다[Figure 1(c)].

NIR-II 형광 이미징 탐침은 단층 탄소 나노튜브(single-walled carbon nanotube, SWCNTs)[7-10], 양자점[11-21], 란탄족 나노입자(lanthanide nanoparticles)[9,22-34], 금 나노클러스터(gold nanoclusters)[35,36], 반 도체 고분자 나노입자(semiconductor polymer dots, Pdots)[37-43], 응 집유도발광 형광체(aggregation-induced emission luminogens, AIEgens) [44-46], 형광 나노리포좀[47-49]과 형광염료가 담지된 고분자 나노입 자[50-54] 등이 개발되어 NIR-II 형광 기반 생체 이미징에 활용될 수 있음이 보고되었다. 이러한 NIR-II 형광 이미징 탐침의 개발과 함께 NIR-II 영역의 광자를 검출할 수 있는 광검출기의 개발과 보급도 NIR-II 형광 이미징 연구의 활성화에 기여하고 있다. 기존의 실리콘 광검출기로는 광자의 에너지가 작은 NIR-II 영역을 검출할 수 없었지 만, 최근 InGaAs 광검출기의 보급으로 NIR-II 형광 이미징 시스템의 구축도 활발해지고 있다.

본 총설은 근적외선-II 영역의 광원을 이용하는 무기 나노입자 기반 이미징 탐침에 대해 기술하고자 한다. 다양한 종류의 무기 나노입자 중에서 활발히 연구되고 있는 단층 탄소 나노튜브와 양자점 및 란탄 족 나노입자에 대해 중점적으로 살펴보고, 이를 활용한 최근 연구 결 과도 함께 다루어 기술하고자 한다.

2. 본 론

2.1. 단층 탄소 나노튜브

단층 탄소 나노튜브는 독특한 밴드갭과 큰 스토크스 이동(Stokes shift)으로 생체 이미징을 위한 형광체로 각광을 받았고 최초로 NIR-II 영역 형광 이미징에 적용된 물질이다[55]. SWCNTs는 일반적으로 NIR-I 영역의 광자를 흡수해서 NIR-II 영역의 형광 신호를 방출하기 때문에, 생체조직 내 투과도를 높일 수 있다. 또한, 자가형광이 최소화 되며 SNR이 향상되었기 때문에 고민감도의 형광 이미징이 가능하다. 하지만 SWCNTs는 수용액에서 잘 분산되지 않으며 생체적합성도 떨 어지기 때문에 소동물 이미징에 직접적으로 사용하는데 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 SWCNTs의 표면을 개질하는 방법들 이 제시되었다[56]. SWCNTs의 표면에 직접적으로 공유결합을 형성 하는 표면개질 방법들이 여러 연구자들에 의해 사용되었으며 분산성 과 생체적합성을 높이는데 적절할 뿐만 아니라 추가적인 작용기를 도 입하여 바이오컨쥬게이션에도 유용함이 보고된 바 있다. 하지만 공유 결합을 이용한 표면개질 방법은 탄소 나노튜브의 컨쥬게이션된 π 네 트워크를 손상시키고 표면에 결함을 유도하기 때문에 형광 양자수율 이 떨어져서 NIR-II 이미징의 선명도가 낮아지는 문제점을 유발한다. 형광 양자수율의 감소를 최소화하기 위해 비공유적인 방법이 시도된 바 있다. Dai 그룹은 SWCNTs를 인지질-폴리에틸렌 글리콜로 표면을 개질하여 분산성과 생체적합성을 확보하는 것뿐만 아니라, 형광 양자 수율도 높게 유지할 수 있었다[55].

최초의 NIR-II 형광 이미징 탐침으로서 SWCNTs는 혈액의 흐름을 관찰하고 림프계 영상 및 영상유도 수술 등에 적용되며 NIR-II 영역을 이용한 형광 이미징의 가능성을 보여주었다[9]. SWCNTs는 높은 시간 분해능과 공간 해상도(300 ms 이하, 약 10 μm)로 마우스의 대뇌 혈관 의 형광 이미지를 두개골을 제거하지 않고 얻을 수 있었다. 일반적인 SWCNTs는 NIR-IIa 영역에서 높은 형광을 방출하지만, 자가형광과 광산란을 더욱 낮추기 위해 NIR-IIb 영역의 장파장을 활용하는 연구 가 시도된 바 있다. NIR-IIa 영역 형광에 사용되던 SWCNTs는 일산화 탄소 불균형 공정(high-pressure carbon monoxide conversion, HiPCO)으 로 합성하며, 1000~1400 nm 영역에서 형광을 발산한다. Dai 그룹은 레이저 증착법(laser vaporization)으로 기존보다 직경이 더 큰 SWCNTs를 합성하여 NIR-IIb 영역의 형광 신호를 대폭 향상시켰다 [Figure 2(a)][8]. 더 긴 파장에서 형광 신호가 나오기 때문에 광산란과 자가형광이 더욱 감소하여 형광 이미지의 품질이 대폭 개선되었다. 전체 NIR-II, NIR-IIa 및 NIR-IIb 영역에서 두개골을 제거하지 않고 마우스의 대뇌에서 나오는 SWCNTs의 형광 신호와 배경 자가형광 신 호도 비교했다[Figure 2(b)]. NIR-IIb 채널에서 약 3 mm 깊이에서 비 침습적인 방식으로 전체 뇌의 선명한 형광 이미징을 얻을 수 있었다. 또한, NIR-I보다 NIR-II가 자가형광이 감소하여 SNR이 2배 정도 향상 되었고, NIR-IIb에서는 자가형광이 대폭 감소하여 NIR-II보다 2배 이 상 SNR이 향상되었으며, 이러한 향상된 SNR 덕분에 보다 선명하게 대뇌의 모세혈관을 관찰할 수 있었다.

2.2. 양자점

양자점(QDs)은 형광염료와 비교하여 광안정성이 우수하고 스토크 스 이동이 큰 장점이 있다. 또한, SWCNTs와 달리 입자의 크기를 조 절하여 발광 파장을 조절하는 것이 용이하다. 높은 형광 양자수율과 장파장에서 형광을 방출하는 PbS QDs은 NIR-II 형광 이미징에 적합 한 광학 특성으로 연구자들의 관심을 받아왔다[14-17]. PbS QDs의 구 성 원소인 납은 중금속으로 독성이 있기 때문에 임상에서 사용되기는 어렵지만 낮은 형광 양자수율을 갖는 SWCNTs에 대한 대체후보로 소 동물 실험에 적용되었다. 수용액 상의 분산성과 생체적합성을 부여하 기 위해 고분자나 단백질로 PbS QDs의 표면을 코팅하였으나, 유기용 매에 분산되었을 때와 비교하여 수용액 상에서 양자수율이 낮아지는 문제점이 있었다[14]. 따라서 PbS가 산화되어 양자수율이 떨어지는 것을 보완하기 위해 CdS 쉘을 PbS 코어에 성장시킨 PbS/CdS 코어/쉘 QDs이 합성되었고, 17%의 형광 양자수율을 달성하였다[57]. 이는 양 자수율이 0.5%인 SWCNTs와 비교하면 월등히 높은 형광 양자수율이 므로 SWCNTs를 대체할 NIR-II 이미징 탐침으로 각광을 받았다. PbS/CdS 코어/쉘 QDs을 말초 동맥 질환 마우스의 혈관에 주입하면 혈관에서 혈류의 흐름을 향상된 시공간 해상도로 보다 선명하게 관찰 할 수 있었다. 최근 발표된 문헌에서는 약 1.2 mm 깊이에서 높은 SNR로 종양의 혈관을 3차원으로 이미징할 수 있는 PbS/CdS 코어/쉘 QDs가 보고되었으며, 808 nm의 광원에서 1600 nm의 NIR-IIb 형광 신호를 발산하므로 자가형광이 거의 검출되지 않고 높은 민감도로 종 양을 관찰할 수 있었다[58]. 또한, PbS/CdS 코어/쉘 QDs은 NIR-II 이 미징과 함께 광에너지를 열에너지로 전환하는 특성도 가지고 있어서 광열치료(photothermal therapy, PTT)에도 함께 활용이 가능하여 테라 노스틱 제제(theranostic agent)로 활용 가능성도 있다[17]. 세포나 소 동물 실험에서는 표면개질된 PbS QDs의 독성이 보고되진 않았지만, 납 독성에 대한 우려는 임상실험에 걸림돌이 되고 있으며, 납이 포함 되지 않은 QDs에 대한 수요가 많았다. PbS QDs의 대체재 중 하나인 InAs QDs는 약 30%의 높은 형광 양자수율과 우수한 광안정성을 갖 는다[18]. 약 3%의 양자수율을 갖는 Ag₂Se QDs과 약 4%의 양자수율 을 갖는 PbS QDs와 비교하면, InAs QDs의 형광세기가 월등히 높은 것을 알 수 있다. InAs QDs는 비침습적인 방식으로 마우스의 호흡속 도와 심장박동을 정량적으로 측정할 수 있었고, 마우스 대뇌의 혈관 구조와 혈류 흐름을 3차원으로 매핑할 수 있었다.

NIR-II 형광 이미징 탐침으로서 Ag₂S QDs와 Ag₂Se QDs에 대한 연 구도 활발히 이루어졌다[11-13]. 유기용매 상에서 고온 반응으로 합성 되는 PbS QDs와 InAs QDs와 달리 Ag₂S QDs와 Ag₂Se QDs는 상대적 으로 저온에서 합성되며 합성된 QDs의 표면이 친수성을 띄게 만들기 용이하다[11]. 또한, 독성 중금속에 대한 우려로부터 자유로울 수 있 다. 수용액 상 분산성과 생체 적합성의 부여가 용이한 Ag₂S QDs은 InAs QDs보다는 양자수율이 낮지만 SWCNTs보다 높은 양자수율 (~15%)을 갖으며, 크기에 따라 900~1250 nm의 영역에서 발광 파장 조절이 가능하다[59]. SWCNTs나 PbS QDs 및 InAs QDs와 마찬가지 로 Ag₂S QDs도 24 μm 수준의 향상된 공간해상도로 마우스의 혈관을 관찰할 수 있었다[60]. 입자의 크기 이외에도 Ag₂Se QDs 및 Ag₂Te QDs와 같이 조성을 변경하여 NIR-IIb 영역까지 형광 파장을 확장할 수 있다[19,20]. Wang 그룹은 Ag₂S QDs와 Ag₂Se QDs을 함께 이용하 여 화학요법(chemotherapy)와 면역요법(immunotherapy)을 생체 내에 서 실시간으로 관찰하였다[19]. 1050 nm의 형광 파장을 갖는 Ag₂S QDs로 항암제인 doxorubicin의 전달을 관찰하고, 이와 함께 1350 nm 의 형광 파장을 갖는 Ag₂Se QDs으로 자연살해세포(natural killer cells) 인 NK-92 세포를 표지하여 면역요법을 동시에 관찰하였다[Figure 3(a)]. 항암제와 함께 NK-92 세포에 대한 케모카인(chemokine)인 SDF-1α를 Ag₂S QDs 나노 전달체에 담지하였으며, 항암제가 종양으 로 전달되는 것을 관찰할 뿐만 아니라 NK-92 세포가 종양에 효과적 으로 전달될 수 있도록 SDF-1α도 함께 전달하였다. 화학요법 이후에 면역요법을 순차적으로 시도한 경우가 두 가지 요법을 동시에 시도한 경우보다 NK-92 세포의 종양 전달 효과가 훨씬 큰 것으로 나타났다 [Figure 3(b)]. 이러한 실험결과는 가시광선 영역에서 가능했던 다중 이미징(multiplexed imaging)이 NIR-II 영역에서도 가능하며, 보다 깊 은 생체 내의 다중 표적을 고해상도로 실시간 관찰과 추적이 가능함 을 의미한다.

일반적으로 가시광선 영역의 형광 특성을 갖는 CdSe QDs의 조성 을 조절하여 NIR-II 영역의 형광을 발산할 수 있도록 밴드갭을 조절하 는 연구도 발표되었다[21]. 반도체 QDs은 일반적으로 입자의 직경을 크게 만들수록 밴드갭이 작아져서 장파장의 형광 특성을 갖을 수 있 다. 하지만 입자의 직경이 커질수록 혈액을 순환하는 시간이 짧아지 고 간을 통해 체외로 배출되기 때문에 입자의 크기를 작게 유지하는 것이 중요하다. 따라서 기존의 입자 크기를 조절하는 방식이 아닌 입 자의 조성을 조절해서 전체 입자의 크기는 유사하게 유지하면서 밴드 갭만 줄이는 연구가 Smith 그룹에 의해 발표되었다[Figure 3(c)][21]. 코어인 CdSe QDs를 양이온 교환(cation exchange) 공정을 이용해서 Cd²⁺를 Hg²⁺로 교체하여 밴드갭이 줄어든 Hg_xCd_1-xSe QDs를 형성한 다. 이어서 형광 파장을 추가적으로 장파장 영역으로 더 이동시키기 위해 밴드갭이 작은 Hg_xCd_1-xS 박막을 Hg_xCd_1-xSe 코어입자 표면에 형 성한다. 마지막으로 밴드갭이 큰 Cd_xZn_1-xS 박막으로 입자의 최외각 표면을 코팅하여 입자의 표면에서 형광소거가 최소화되어 발광효율 이 향상될 수 있도록 하였다. 이러한 순차적인 양이온 교환과 코어/쉘 형성 공정을 통해 직경 4 nm의 CdSe 코어입자는 2 nm 정도의 크기 증가에도 불구하고 600 nm에서 1400 nm까지 형광 파장을 조절할 수 있었다. 그리고 파장이 장파장으로 이동할수록 자가형광이 대폭 감소 하여 SNR이 크게 증가하는 것도 실험적으로 확인되었다[Figure 3(d)].

가시광 QDs에 비해 NIR-II QDs은 형광세기가 일반적으로 더 약하 기 때문에, 깊은 투과도와 높은 SNR에도 불구하고 영상 품질이 기대 만큼 좋지 않은 경우가 있다. 따라서, 많은 연구자들이 NIR-II QDs의 형광세기를 높이기 위한 방법을 연구하였다. 일반적으로 밴드갭이 큰 쉘로 밴드갭이 작은 코어를 보호하는 코어/쉘 형성이 이용되는데, Jaque 그룹은 기존의 용액상 고온 합성이 아닌 펨토초 레이저를 이용 한 코어/쉘 형성 방법에 대해 연구하였고, 코어입자에 비해 80배의 형 광세기 증가를 보고하였다[13]. 앞서 기술된 바와 같이 Ag₂S QDs는 생체적합성이나 저온 합성 및 친수성 표면 도입의 용이성 등 장점에 도 불구하고 PbS QDs나 InAs QDs에 비해 양자수율이 낮은 문제점이 있다. Jaque 그룹은 양자수율이 1% 미만인 Ag/Ag₂S 이종이합체 (heterodimers) QDs의 표면을 AgCl 박막으로 보호하여 입자 표면에서 발생하는 비방사성 소광을 최소화하였다. Jaque 그룹은 Ag/Ag₂S QDs 를 Ag₂S QDs라 명명하였으나 본 총설에서 언급된 다른 연구자들의 Ag₂S QDs와 조성이 다르므로 구별되어야 한다. Ag/Ag₂S QDs을 Ag 나노입자와 함께 클로로포름(CHCl₃)에 분산시킨 후 50 펨토초로 레이 저를 쪼여주면 Ag 나노입자가 분해되어 용매와 반응하며, 이 과정에 서 AgCl 보호막이 Ag/Ag₂S QDs 표면에 형성된다. Ag/Ag₂S QDs 표 면에 형성된 AgCl 보호막은 TEM 분석과 1200 nm에서의 형광세기 증가를 통해 확인되었다[Figure 4(a)]. 1% 미만의 양자수율은 10% 이 상으로 대폭 향상되었고, 기존 보고된 SWCNTs, LaF₃:Nd³⁺ 란탄족 나 노입자, Ag/Ag₂S QDs에 비해 우수한 SNR을 보여주었다[Figure 4(b) and Table 1]. 그리고 이렇게 향상된 NIR-II 형광세기 덕분에 기존 다 른 NIR-II 이미징 탐침에 비해 훨씬 낮은 용량과 낮은 광원 세기로도 형광 이미지를 얻을 수 있으므로[Figure 4(c)], 향후 임상에 적용하는 데 유리할 것이다.

2.3. 란탄족 나노입자

란탄족 나노입자는 양자점과 달리 양자제한효과에 의해서 밴드갭 이 변하지 않기 때문에, 입자의 크기에 따른 형광 파장의 변화가 없다. 대신 란탄족 나노입자는 란탄족 원소가 갖는 고유의 에너지 준위에 따라 형광 파장이 결정되며, 한 가지 란탄족 원소 내에서도 여러 에너 지 준위가 사다리처럼 형성되어 있어서 일반적으로 한 개 이상의 파 장에서 형광 신호가 나올 수 있다. 예를 들면, Er³⁺이온은 녹색과 붉은 색 파장의 빛이 동시에 나오며, Tm³⁺은 파란색 파장의 빛이 방출된다. 원자의 에너지 준위에 따라 형광 파장이 결정되므로 형광 파장 대여 폭(bandwidth)이 좁은 양자점보다도 더 좁은 형광 파장 대여폭을 갖는 다. 란탄족 나노입자는 일반적으로 호스트 물질에 광자를 흡수하거나 형광을 발산하는 란탄족 원소들이 도핑되는 형태로 구성되며, 양자점 과 마찬가지로 양자수율을 높이기 위해 형광 특성을 갖는 도펀트가 포함된 코어입자의 표면을 도펀트가 포함되지 않은 호스트 물질 쉘로 보호하는 코어/쉘 구조를 일반적으로 갖는다. 란탄족 나노입자 중 지 난 20년간 많은 연구자들의 관심을 받았던 물질이 업컨버전 나노입자 (upconversion nanoparticles)이다[61]. 업컨버전 나노입자는 반-스토크 스 이동(anti-Stokes shift)에 의해 낮은 에너지를 갖는 장파장의 광자 를 여러 개 흡수하여 높은 에너지를 갖는 단파장의 가시광선이나 자 외선 영역의 빛으로 방출한다. 업컨버전 나노입자는 다른 종류의 반- 스토크스 이동 물질인 세컨하모닉 생성(second-harmonic generation, SHG)이나 다광자 흡수(two-photon absorption, TPA) 물질에 비해 발 광효율이 월등히 높기 때문에, NIR-I 영역의 광원을 이용해서 가시광 선 영역의 형광 신호를 관찰할 수 있는 이미징 탐침 물질로 폭넓게 연구되었다. NIR-I 영역의 광원은 기존의 자외선이나 가시광선 광원 에 비해 생체조직 내 투과 깊이가 깊고 자가형광이 낮아 고선명도의 형광 이미지를 얻을 수 있는 장점이 있었으나, 다광자 흡수에 의한 가 시광선 발광 메커니즘의 한계로 양자수율이 낮을 수밖에 없고, 생체 조직 내에서 방출되는 가시광선 형광 신호가 체외로 전달되는 과정에 서 신호 손실이 있을 수밖에 없다.

이러한 업컨버전 나노입자를 활용하는 기존의 연구들이 대부분 실 리콘 광검출기를 이용한 가시광선 영역의 형광 이미지 관찰에 초점을 맞췄으나, Moghe 그룹은 업컨버전 형광 신호뿐만 아니라 스토크스 이동에 의한 NIR-II 영역의 형광 신호에도 관심을 가지고 연구를 수행 하였고, 기존 보고된 업컨버전 나노입자들은 대부분 스토크스 이동 (또는 다운컨버전, downconversion, 또는 다운쉬프팅, downshifting)에 의해 NIR-II 영역에서도 형광을 발산함을 발견했다[62]. 업컨버전에서 형광 파장을 결정하는 활성제인 Er³⁺, Ho³⁺, Tm³⁺, Pr³⁺ 모두 NIR-II 영 역에서 형광을 발산하며, 그 중에서 Er³⁺의 NIR-II 발광효율이 월등히 높은 것으로 관찰되었다. 980 nm의 NIR-I 광자를 흡수하는 증감제인 Yb³⁺와 발광효율이 우수한 Er³⁺가 함유된 란탄족 나노입자가 1525 nm NIR-II 형광 이미징에 활용되었으며, 808 nm NIR-I 형광은 5 mm 투 과깊이에서 형광 신호가 모두 사라진 반면, 1525 nm NIR-II 형광은 10 mm 투과깊이 까지도 형광 신호가 관찰되었다. 기존에 많이 사용 되는 NIR-I 영역 광자 흡수제인 Yb³⁺는 980 nm의 광자를 흡수하는데 물이 980 nm의 광자를 잘 흡수하기 때문에, 980 nm 레이저의 가열효 과에 의해 세포나 조직의 손상을 유발할 수 있는 단점이 존재한다 [63]. 따라서 980 nm 대신 808 nm 레이저를 사용하려는 연구가 수행 되었고, 이미 업컨버전 나노입자에서는 808 nm 광원을 흡수하는 Nd³⁺ 를 Yb³⁺와 함께 도핑하는 입자조성이 많이 사용된다. 이 경우 Nd³⁺가 808 nm 광자를 흡수하여 그 에너지를 Yb³⁺로 전달하며, Yb³⁺는 이 에 너지들을 활성제인 Er³⁺나 Tm³⁺에 전달하여 가시광 업컨버전 형광이 발산된다. NIR-II 형광 란탄족 나노입자는 Nd³⁺이온이 증감제와 활성 제로 동시에 작용할 수 있으며, 808 nm의 광원에서 1060 nm와 1340 nm의 NIR-II 형광을 발산한다[64]. 1060 nm 영역이 형광세기가 크기 때문에 주로 활용되며, NIR-IIb 영역은 활용할 수 없는 한계가 존재한다.

업컨버전 형광과 마찬가지로 NIR-II 형광도 다양한 에너지 준위를 제공하는 란탄족 원소들에 의해 NIR-II 영역 발광 파장을 조절할 수 있다. 란탄족 원소들의 조합으로 형광 파장과 형광세기를 조절할 수 있으며, 도펀트로 작용하는 란탄족 원소들의 함량을 조절하여 형광 수명도 조절이 가능하다. 무엇보다 기존의 업컨버전 나노입자의 조성 이 가시광선 영역의 업컨버전 형광을 극대화하는 방향으로 최적화되 었기 때문에, NIR-II 영역 다운컨버전 형광을 향상시키기 위해서는 새 로운 물질 조성의 탐구가 필요하다. 즉, 흡수된 NIR-I 광자가 가시광 선 영역의 업컨버전 형광으로 발산되는 것을 최소화하고 NIR-II 영역 형광으로 발산되는 것이 극대화되는 에너지 전달에 효과적인 새로운 입자 구조를 발굴해야 한다. 이를 위해서 Ce³⁺이나 Eu³⁺ 이온을 Er³⁺ 이온과 함께 도핑하는 방법들이 보고되었다[32,65]. Dai 그룹은 NaYbF₄:Er/NaYF₄ 나노입자에 Ce³⁺이온을 첨가하여 NIR-II 형광세기 를 증가시키는 방법을 보고하였다[65]. Ce³⁺ 이온과 Er³⁺ 이온 간의 비 방사성 포논 교차 이완(nonradiative phonon-assisted cross relaxation) 에 의해 업컨버전 형광을 억제하고 1550 nm의 형광으로 발산될 수 있 도록 하였으며, 이를 통해 형광세기를 약 9배가량 증가시켰다. 그리고 Ce³⁺이온에 Zn²⁺이온을 추가로 첨가하여 육각형(hexagonal phase) 결 정구조에서 입방체(cubic phase) 결정구조로의 변화와 함께 NIR-II 형 광의 세기를 11배가량 증가시키기도 했다[66]. Tian 그룹은 Eu³⁺ 이온 과 Ce³⁺ 이온을 추가로 도핑하여 1524 nm의 NIR-II 형광세기를 향상 시켰다[32]. 5%가 도핑되었을 때는 Ce³⁺ 이온에 의한 NIR-II 형광증가 가 Eu³⁺보다 더 우세했고, 2%가 추가로 도핑되었을 때는 Eu³⁺ 이온이 Ce³⁺이온보다 더 높은 NIR-II 형광세기 증가를 나타냈다[Figure 5(a)]. 이 경우에도 앞서 Ce³⁺이온과 마찬가지로 Eu³⁺이온과 Er³⁺이온 간의 비방사성 포논 교차 이완에 의해 업컨버전 형광을 억제하여 NIR-II 형 광을 증가시킨 것이다[Figure 5(b)]. 또한 Ce³⁺이나 Eu³⁺ 이온의 추가 적인 도핑에 따라 육각형에서 입방체로 결정구조가 변환되었으며 1524 nm의 형광 수명도 증가하는 것이 관찰되었다.

업컨버전 나노입자에서는 호스트 물질의 결정구조와 코어/쉘 구조 의 형성 및 쉘 두께에 따른 업컨버전 발광효율에 대한 연구가 많이 보고된 바 있으나[67], NIR-II 형광을 나타내는 란탄족 나노입자에도 이러한 요소가 동일하게 적용된다고 볼 수 없다. 따라서 Chen 그룹은 이러한 요소들이 NIR-II 발광효율에 미치는 영향을 체계적으로 연구 하였다[31]. NIR-II 란탄족 나노입자는 업컨버전 나노입자와 달리 코 어의 결정구조가 형광효율에 큰 영향을 주지 못했는데, 이는 코어입 자의 직경이 7.4 nm로 작기 때문에 입자의 결정구조보다는 표면에서 발생하는 소광(quenching) 효과가 더 크기 때문이었다[Figure 5(c)]. 코 어입자의 표면에서 발생하는 소광을 억제하기 위해 도펀트가 없는 쉘 을 표면에 성장시키면, 입방체 결정구조와 육각형 결정구조 모두 1400 nm~1700 nm의 영역에서 형광세기가 약 60배와 180배로 큰 폭 으로 증가하였다. NIR-II 형광뿐만 아니라 가시광 업컨버전 형광도 큰 폭으로 증가하였으며, 이는 도펀트가 없는 쉘의 형성이 표면에서의 형광 소광을 효과적으로 억제함을 의미한다. 또한 쉘의 두께에 따른 NIR-II 형광특성도 관찰하였는데, 쉘의 두께가 증가할수록 NIR-II 형 광세기가 증가하였으며, 3 nm가 최적의 두께였다[Figure 5(d)]. 란탄 족 나노입자의 코어에 도핑된 활성제 원소와 입자 표면의 소광제 (quencher) 사이의 거리가 쉘의 두께가 증가할수록 멀어지므로, 쉘이 두꺼워질수록 활성제 원소와 소광제 사이의 에너지 전달 효율이 낮아 져서 NIR-II 형광세기가 증가하는 것이며, 3 nm 이상에서는 활성제 원소와 소광제 사이의 거리가 충분히 멀어서 더 이상 쉘의 두께가 에 너지 전달에 크게 영향을 주지 않는 것이다.

란탄족 원소는 10 nm 내외의 좁은 흡광영역과 형광염료보다 약 1000배 정도 낮은 광흡수율을 갖기 때문에, 란탄족 나노입자는 형광 염료나 양자점에 비해 양자수율이 낮은 단점이 있다[68]. 이러한 단점 을 개선하기 위해 흡광영역이 넓고 광흡수율이 상대적으로 우수한 형 광염료를 란탄족 나노입자와 결합시켜 NIR-I 광원을 흡수하는 안테나 로 활용하는 연구가 보고된 바 있다. Prasad 그룹은 NIR-I 영역의 형 광염료인 ICG를 란탄족 나노입자에 부착하여 808 nm에서의 광흡수 율을 향상시켰고, 이를 통해 NIR-II 영역 형광세기를 약 4배 정도 향 상시켰다[69]. 이와 달리 형광염료를 광 흡수제로 사용하는 것뿐만 아 니라 외부 자극에 선택적으로 반응하는 표지물질로 활용한 연구도 있다 (Figure 6). Zhang 그룹은 1060 nm의 NIR-II 광원을 흡수하는 MY-1057 형광염료를 란탄족 나노입자(NaYF₄/NaYF₄:Nd)에 소광제로서 적용하 였다. 간세포암(hepatocellular carcinoma)에서는 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)인 peroxynitrite (ONOO^-)가 정상세포보다 많으 며, MY-1057은 이러한 ONOO^-에 선택적으로 반응하여 분해된다. 따 라서, MY-1057이 결합된 란탄족 나노입자는 간세포암에서 MY-1057 이 선택적으로 분해되어 소거제로서의 능력을 잃어버리기 때문에, 란 탄족 나노입자로부터 나오는 1060 nm의 NIR-II 형광 신호가 증가한 다. 따라서, 1060 nm의 형광 신호를 관찰하여 간세포암을 진단할 수 있다. 이와 함께 Zhang 그룹의 연구결과가 흥미로는 점은 MY-1057의 분해에 따라서 NIR-II 형광 신호뿐만 아니라 형광 수명도 함께 증가한 다는 점이다[Figure 6(a)][28]. NIR-II 형광 신호는 기존 가시광선에 비 해 생체 내 투과도가 우수하지만, 실험에서 생체 깊숙한 곳으로 갈수 록 활성질소종의 양에 따른 NIR-II 형광 신호의 변화를 감지하기 어려 워지며, 5 mm 투과깊이에서는 형광 신호 변화가 거의 감지되지 않았 다[Figure 6(b)]. 하지만, 활성질소종의 양에 따른 형광 수명의 증가는 생체 내 투과 깊이에 상관없이 일정한 민감도를 보여주었다[Figure 6(c)]. 따라서 NIR-II 영역 형광 신호와 형광 수명의 변화를 함께 관찰 하여 보다 정확하게 간세포암을 진단하고, 이를 이미징 유도 수술에 도 활용할 수 있는 가능성을 보여주었다.

3. 결 론

본 총설에서는 광원의 생체조직 내 투과도를 높이고 생체조직의 자 가형광을 최소화하여 비침습적인 방식으로 소동물의 혈관이나 종양 을 실시간으로 관찰할 수 있는 NIR-II 형광 무기 나노입자 기반 이미 징 탐침에 대해 기술하였다. 기존 가시광선 형광 이미징의 단점을 보 완하기 위해 NIR-I 영역의 형광물질이 이미징 탐침으로 개발되었으 나, 광산란과 자가형광을 더욱 최소화하여 형광 이미지의 품질을 향 상시키기 위해 NIR-II 영역의 장파장을 활용하려는 연구가 많은 주목 을 받고 있다. 유기 형광체, 고분자 나노입자, 나노리포좀 및 무기 나 노입자 등 다양한 NIR-II 형광 이미징 탐침이 연구되고 있으며, 화학 적 안정성과 광안정성, 생체적합성, 발광 파장 조절 등의 특성이 각 물질별로 다르기 때문에, 활용 목적에 따라 적합한 물질을 선택할 필 요가 있다. 나노입자는 유기 형광체에 비해 크기가 크기 때문에, 생체 내에서 신장을 통한 빠른 배출이 어렵다. 그래서 잠재적인 독성 이슈 로 미국 식품의약청의 승인을 받기 어려워서, 최근에는 상용화와 임 상 적용을 위해 NIR-II 유기 형광체의 개발에도 많은 연구자들이 관심 을 갖고 있다. 하지만, 유기 형광체는 타겟팅 리간드나 약물과의 컨쥬 게이션이 제한적이고 광안정성 향상이 필요하다. 따라서 본 총설에서 는 SWCNTs, QDs, 란탄족 나노입자와 같이 광안정성이 뛰어나고 발 광 파장 조절이 용이한 무기 나노입자 기반 이미징 탐침을 중점적으 로 다루었다.

초기 NIR-II 이미징에 적용되었던 SWCNTs는 NIR-II 형광을 생체 이미징에 활용 가능함을 실험적으로 증명하여 해당 분야의 연구가 활 성화되는 데 기여하였다. 다만, SWCNTs는 상대적으로 낮은 양자수 율과 잠재적인 생체 독성 등의 문제점을 해결할 필요가 있다. QDs은 SWCNTs에 비해 상대적으로 높은 양자수율과 발광 파장의 조절이 자 유로운 장점이 있어 NIR-II 영역에서 고민감도 형광 이미징이 가능하 다. 다만, 양자수율이 높은 PbS나 InAs QDs는 중금속에 의한 잠재적 인 생체 독성 가능성이 임상 적용을 어렵게 하며, Ag₂S QDs나 Ag₂Se QDs는 상대적으로 낮은 양자수율과 낮은 화학적 안정성 등이 개선되 어야 할 필요가 있다. 란탄족 나노입자는 란탄족 원소의 에너지 준위 에 따라 NIR-II 영역의 형광이 나타나며, 업컨버전 가시광과 NIR-II 형광이 동시에 나오는 경우가 많기 때문에, 업컨버전 가시광을 억제 해서 NIR-II 형광세기를 높이려는 연구가 많이 진행되고 있다. 다만, 란탄족 나노입자는 란탄족 원소의 낮은 광흡수율이 양자수율을 향상 시키는 걸림돌이 되기 때문에, 이를 개선하려고 광흡수율이 높은 형 광염료나 양자점을 란탄족 나노입자와 접목시키는 연구들이 시도되 고 있다. 이러한 NIR-II 이미징 탐침의 개발과 함께 NIR-II 검출기의 개선과 보급도 함께 이루어져야 한다.

기존 상용화된 광학 분석장비나 이미징 장비가 대부분 NIR-II 영역 의 형광 신호 검출을 지원하지 않기 때문에 대부분의 연구자들이 직 접 제작한 장비들을 사용하며, 이러한 점이 기존 발표되는 논문들의 수치 데이터들을 동일 선상에서 비교하고 검증하기 어렵게 한다. 이 러한 NIR-II 이미징 탐침의 개발과 NIR-II 장비의 보급은 기존 형광 이미징 기법의 활용도를 대폭 높일 수 있을 것으로 기대하며, 기존 형 광 이미징으로 관찰할 수 없었던 것을 가능하게 할 것이므로, 기초 연 구 분야 뿐만 아니라 임상 분야에도 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대한다. 다만, 생체적합성 확보와 잠재적인 독성 이슈의 해결은 반 드시 해결되어야 할 것이다.

감 사

이 논문은 한국연구재단(과제번호: 2021R1I1A3047374)과 전남대 학교 학술연구비(과제번호: 2020-1873)의 지원에 의하여 연구되었음.

Figures

Figure 1.(a) Classification of wavelengths used for fluorescence imaging. (b) The reduced scattering coefficients of skin (black), subcutaneous tissue (red), skull (blue), and brain tissue (green) in the 400-1700 nm range. (c) Autofluorescence spectra of mouse organs ex vivo. Reprinted with permission from ref [5].

Figure 2.(a) (Left) Absorption spectrum of water and extinction spectra of mouse skin and mouse muscle, (Right) NIR-II fluorescence spectra of HiPCO and semiconductor LV SWCNTs upon excitation at 808 nm. (b) Fluorescence images and corresponding signal-to-background ratio (SBR) analysis of mouse cerebrovascular structures in the NIR-I, NIR-II and NIR-IIb regions. Reprinted with permission from ref [8].

Figure 3.(a-b) Multiplexed NIR-II fluorescence imaging using Ag₂Se and Ag₂S QDs[19]. (a) Schematic diagram of programmable chemotherapy and immunotherapy for breast cancer. To monitor each treatment modality, chemodrugs were labeled with Ag₂Se QDs (1350 nm) and natural killer (NK)-92 cells were labeled with Ag₂S QDs (1050 nm). (b) NIR-II fluorescence images after programmed injection of Ag₂Se and Ag₂S QDs into MDA-MB-231 tumor bearing mice. (c-d) Three-domain QDs with visible-to-NIR-II emission[21]. (c) (Top) Schematic illustration of the synthesis of 3-domain QDs from CdSe core to (Hg_xCd_1-xSe)HgyCd1-yS/CdzZn1-zS QDs, (Bottom left) absorption coefficient spectra of the QDs, (Bottom right) photoluminescence spectra of the QDs. (d) (Left) Comparison of single QD intensity and cellular autofluorescence (AF) intensity, (Right) signal-to-background ratio for each QD. Reprinted with permission from refs [19, 21].

Figure 4.(a) (Top) STEM micrograph and X-ray intensity profile of Ag₂S superdots (Ag₂S/AgCl), (Middle) optical images of Ag₂S and Ag₂S superdot samples and NIR-II fluorescence images of the samples excited at 808nm, (Bottom) increased NIR-II fluorescence by AgCl shell formation upon laser irradiation. (b) Signal-to-noise ratio (SNR) as a function of power density for four types of NIR-II nanoprobes (Ag₂S superdots, commercial Ag₂S dots, SWCNTs, and LaF3:NdNPs) and fluorescence images of Ag₂S superdots in liver at three different 808 nm excitation power densities. (c) NIR-II fluorescence images of mice subcutaneously injected with four types of NIR-II nanoprobes. Reprinted with permission from ref [13].

Figure 5.(a) Upconversion and NIR-II emission spectra of Yb,Er/Nd, Yb,Er,Eu/Nd, and Yb,Er,Eu/Nd nanoparticles (The concentration of Eu and Ce is 2%)[32]. (b) Luminescence energy transfer process of Yb,Er,Eu/Nd nanoparticles[32]. (c) Comparison of NIR-II emission spectra and intensity of α- and β-Er core nanoparticles and α- and β-Er/Y core/shell nanoparticles under 808 nm excitation[31]. (d) Shell thickness dependence of upconversion and NIR-II (downshifting) spectra of β-Er /Y nanoparticles at 808 nm excitation[31]. Reprinted with permission from refs. [31, 32].

Figure 6.(a) Schematic for lifetime-based detection of hepatocellular carcinoma (HCC) in the NIR-II region. Since the MY-1057 is sensitively decomposed by ONOO^-, the lifetime of the DSNP/MY-1057-GPC-3 nanosensor is recovered in the NIR-II region in the presence of ONOO^-. (b) NIR-II intensity and lifetime-based imaging results as a function of ONOO^- concentration of DSNP/MY-1057-GPC-3 nanosensors at different penetration depths. (c) Analysis of dependence of NIR-II intensity and fluorescence lifetime on ONOO^- concentration and penetration depth obtained from Figure 6b. Reprinted with permission from ref [28].

Tables

Table 1.Photoluminescence Properties of NIR-II Imaging Probes Dispersed in Phosphate-Buffered Saline. Reprinted with Permission from Ref [13]

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