1. 서 론

예방주사라고도 불리는 백신은 감염성 질병에 대한 후천적 면역을 부여하기 위한 의약품이다. 백신은 감염성 질병의 항체가 형질세포에 서 생성되도록 무력화한 병원체나 항원 물질로 작용할 수 있는 물질 을 면역계에 전달한다. 활성이 약화 혹은 제거된 병원체를 주입하거 나, 이종 병원체 혹은 스파이크 단백질과 같은 항원 결정 부위를 주입 하는 등의 기존 백신과는 달리 항원에 대한 유전 정보를 담고 있는 유전자를 전달하는 핵산 백신이 코로나19를 기점으로 크게 대두되고 있다. 핵산 백신은 크게 RNA와 DNA 백신으로 나눌 수 있다[1]. RNA 백신은 바이러스 특이 스파이크 단백질을 만드는 유전자를 RNA 형태 로 만들어 인체에 투여하는 백신을 의미한다. 최근, 코로나19 백신으 로 모더나사와 화이자사에서는 mRNA 백신을 제작했다. mRNA는 핵 까지 도달하지 않더라도 세포질 내에서 바로 항원단백질이 발현된다 는 장점이 있으나, 물질의 안정성이 낮아 쉽게 손상되어 초저온으로 얼리거나 동결건조하여 보관해야 한다는 단점이 존재한다[2,3]. 반면 얀센사에서 채택한 DNA 백신은 세포핵 내부에 도달해 전사 과정을 통해 mRNA가 생성된 뒤에 항원단백질로 번역된다. DNA 백신은 백 신이 핵막 내부로 전달되는 과정이 추가된다는 단점이 존재하지만 이 중 가닥의 형태로 단일 가닥인 RNA에 비해 더 안정적이므로 보관이 용이하다는 장점을 가지고 있다[4,5]. 또한, 최근 유전자 기반 백신을 감염성 질환뿐만 아니라 암, 자가면역 질환 치료 등을 포함하여 다양 한 분야에 적용하려는 시도가 계속되고 있다.

기존의 DNA 기반 백신은 주로 바이러스성 벡터를 이용하고 있다. 바이러스성 벡터는 인간 세포를 숙주로 자신의 유전물질을 전달하는 바이러스 고유의 세포 내 침투 기전을 사용하기 때문에 유전자의 손 실이 적어 최초 접종 시 높은 전달 효율을 보인다. 벡터로 가장 많이 사용되는 바이러스로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스 등이 있다. 하 지만 벡터로 바이러스를 사용하기 때문에 과거 체내에 해당 바이러스 가 들어와 이미 항체가 생성되었다면 이에 대한 면역반응이 강하게 발생한다는 단점이 존재한다. 따라서, 한 가지 벡터당 1회만 사용이 가능하다는 특징 때문에 상용화된 바이러스 벡터로 예방할 수 있는 감염병의 수는 극히 제한적이다[6,7]. 이와 같이 명확한 한계점이 존 재하는 바이러스성 벡터를 대체하기 위해 비바이러스성 벡터를 사용 할 수 있다[4]. 비바이러스성 벡터의 경우, 지질이나 고분자와 같은 물 질과 유전자 간의 정전기적 인력에 의한 결합력을 사용하여 전달체를 형성한다. 따라서, 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터와 달리 전달 체에 대한 항체가 생성되지 않으며 생체 적합성이 높은 물질로 제조 하기 때문에 바이러스성 벡터에 비해 범용성이 높다. 그러나 소수성 물질을 사용하면 체내 주입을 위해 식염수에 입자를 희석할 때 입자 간의 응집이 일어날 수 있다. 또한 입자의 크기에 따라 간이나 신장에 서 입자가 걸러지며 체내에서 빠르게 배출되는 문제점이 있다. 이와 같은 한계를 보완하고자 약물의 혈중 반감기와 수용성을 증가시키거 나 면역원성과 항원성을 감소시키기 위해 전달체의 표면에 PEG (polyethylene glycol)을 부착해 “PEGylation” 시키는 경우가 많다[8]. 그러나 간혹 첫 접종에서 PEG에 대한 항체가 생성되어 2회 이상 접종 시 전달 효과가 떨어지거나 코로나 백신의 부작용으로 보고되고 있는 아나필락시스와 같은 PEG에 대한 알레르기 유사 반응을 보이는 환자 들이 존재한다는 한계점이 있다[9,10]. 또 다른 한계점은 바로 비바이 러스성 벡터의 고질적인 문제점인 엔도좀 탈출이다. 비바이러스성 벡 터는 엔도좀을 형성하며 세포 내부로 들어가게 되는데, 전달된 물질 이 엔도좀을 탈출해 세포질에 도달하는 효율은 10% 미만으로 매우 낮으므로 접종 효과 저해가 일어나게 된다. 따라서 유효한 접종 효과 를 위해서는 실제 필요한 접종량의 10배 이상의 유전자를 필요로 한 다는 점에서 비효율적일 수 있다[11].

앞서 설명한 기존 핵산 전달체의 한계를 극복하고자 이번 연구에서 는, 양전하를 띠는 폴리에틸렌이민(이하 PEI)과 음전하를 띠는 플라스 미드 DNA(이하 pDNA)를 섞어 전체적으로 양전하를 띠는 폴리에틸 렌이민-플라스미드 DNA 복합체(이하 polyplex)를 제작한 후, 음전하 를 띠는 히알루론 아민(이하 HA)으로 코팅해 polyplex-HA를 완성하 였다(Figure 1)[12,13]. PEI의 양성자화 되지 않은 아민이 엔도좀 내에 존재하면, 양성자를 흡수할 수 있고 리소좀 내부로 염화이온이 배출 되어 이온 농도 상승을 촉진한다. 이후 삼투 현상으로 물이 유입되어 엔도좀의 붕괴가 일어나기 때문에 엔도좀 탈출 효율이 증가한다[14]. 또한, 전달체의 친수성을 높이고, 음전하를 띠는 세포막에 양이온성 입자가 결합하는 것을 방지하고자 히알루론 유도체를 사용했으며, 이 는 생체 유래 물질이므로 PEG와 달리 아나필락시스 발생 위험이 적 다[15-17]. 본 연구팀이 제작한 전달체는 세포 내 pDNA 전달 효율을 최대화 시키며 낮은 독성을 가지고 있어 세포 손상을 최소화 할 것으 로 예상한다. pDNA, PEI, HA의 최적 비율을 찾기 위해 다양한 비율 로 입자를 제작해 그 크기와 pDNA 발현 정도를 비교했다. 제작 비율 확정 후 완성된 입자를 검증하기 위해 polyplex와 polyplex-HA의 크 기, 제타 전위와 같은 물리적 특성을 확인하고 정성/정량적으로 전달 및 발현 효율을 확인하고 독성 평가를 진행했다.

2. 실 험

2.1. 실험 자재

히알루론 아민(10kDa)은 Creative PEG Works (Chapel Hill, NC, USA) 에서 구입했다. 폴리에틸렌이민 염산염(PEI HCl, linear, 평균 분자량 20KDa), HEPES buffer solution (1M in H₂O), D-(+)-Glucose, MTT [3- (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide], Dimethyl sulfoxide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. td-Tomato pDNA는 Clontech (Mountain View, CA, USA)에서 구입했 다. 녹색 형광 단백질 pDNA는 Addgene (Watertown, MA, USA)에서 얻었다. UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water, Lipofectamine 2000^®, Opti-MEM, TO-PRO™-3 Iodide(642/661), Slide-A-Lyzer™ G2 Dialysis Cassettes (20k MWCO)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입했다. Nuclease Free Water (이하 NFW)는 QIAGEN (Düsseldorf, Hilden, Germany)에서 구입했다. 인간 유방암 세포주(이하 MCF-7)는 KCLB (한국 세포주 은행, 서울, 대한민국)로 부터 구입했다. 세포 성장 배지(DMEM-F12), 태아 소 혈청(FBS), 페 니실린-스트렙토마이신(100X) 용액은 웰진(경상북도, 한국)에서 구입 했다.

2.2. polyplex-HA 제작 및 정제

입자 제작에 앞서 용매로 사용되는 HEPES buffered glucose (HBG) 용액을 제작하기 위해 NFW로 20 mM 농도가 되도록 희석한 HEPES buffer에 5%wt glucose를 용해시켜준다. PEI-HCl (20kDa) 를 HBG에 1 mg/ml의 농도로 녹이고, 히알루론 아민은 NFW에 2 mg/ml의 농도 로 녹인다. 실험 진행에서의 편의를 위하여 N/P 비율을 미리 무게 비 율로 환산한 뒤 실험을 진행했다. PEI 수용액과 pDNA 수용액을 여러 비율로 혼합해준다. 혼합된 용액을 상온에서 30분 반응시켜 자가조립 을 통해 polyplex가 생성되도록 한다. 이후, 히알루론 아민 수용액을 여러 비율로 혼합해준다. 혼합된 용액을 상온에서 30분 반응시켜 polyplex의 표면이 히알루론 아민으로 충분히 코팅되도록 한다. 반응이 완료된 입자를 20kDa Slide-A-Lyzer™ G2와 UltraPure™ DNase/RNase- Free Distilled Water를 이용해 두 시간 이상 투석하여 미 반응 히알루 론 아민을 제거해 정제된 polyplex-HA 입자를 완성했다.

2.3. 입자 생성 확인

복합체가 형성되었는지 확인하기 위해 ZETASIZER PRO(Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, UK)를 사용하여 polyplex 및 polyplex- HA 입자의 크기와 표면 제타 전위를 측정했다. 120 kV에서 작동 하는 에너지 필터링 투과 전자 현미경(EF-TEM, LIBRA 120, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 나노 입자의 모습을 관찰했 다. 400 mesh 탄소 코팅 그리드(Ted Pella Inc., Redding, CA, USA)에 10 ul의 샘플을 사용했고, 샘플은 UranyLess (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)로 염색되었다.

2.4. 세포 실험

MCF-7 세포는 5% 이산화탄소의 습한 대기와 37 °C의 배양액 [10% 소태아혈청 (FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM-F12]에서 배양되었다. 실험 진행 20시간 전에 6-well plate 또 는 flat bottom confocal dish에 세포를 80%의 밀도로 준비했다. 양성 군은 50μl Opti-MEM에 1 μg의 pDNA를, 50 μl Opti-MEM에 3μl의 Lipofectamine^® 2000을 희석하고 두 희석액을 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 두어 준비했다. Polyplex와 polyplex-HA를 세포에 처리하 기 전에 배지를 Opti-MEM 100 μl 및 DMEM-F12 900 μl로 교체하였 으며, 이후 1 μg의 pDNA에 해당하는 polyplex와 polyplex-HA를 각 실험군에 첨가했다. polyplex와 polyplex-HA의 세포 내 흡수를 위한 3 시간의 배양 후, 배지를 배양액 조성 배지로 교체하고 전사 및 단백질 형성을 위해 인큐베이터 내부에서 추가로 배양했다.

2.5. 현미경 관찰

적색 형광 단백질을 발현하는 pDNA를 이용해 polyplex와 polyplex- HA를 제작했다. 2.4 과정 후 배지를 걷어내고 세포를 멸균 PBS 로 조심스럽게 세척한 다음, 4% 파라포름알데히드 용액 1 ml를 첨가 하여 37 °C 인큐베이터에서 5분간 세포를 고정했다. 고정이 완료된 세포를 멸균 PBS로 2회 세척하고 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 용액 1 ml를 첨가하여 37 °C에서 5분간 세포핵을 염색하였다. 이후, 멸균 PBS으로 2회 세척하고 Alexa488-phalloidin 용액을 1 ml 첨가하 여 37 °C에서 6시간 세포 골격을 염색했다. 마지막으로 멸균 PBS로 잔여 염색물질을 세척하고 1ml의 멸균 PBS를 채운 후 형광 레이저현 미경[Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)]으로 DAPI(378 nm), FITC(474 nm), TRITC(554 nm) 채널을 통해 관찰했다.

2.6. 유세포분석

Polyplex와 polyplex-HA를 형성하기 전에 입자의 세포 내 분포를 추적하고자 녹색 형광 단백질을 발현하는 pDNA에 TO-PRO™-3 iodide (642/661)를 이용해 표지 했다. 2.4. 과정 후 각 그룹의 세포를 수 확하여 멸균 PBS에 담아 FACS 튜브로 옮겨 담았다. BD Accuri™ C6 Plus Flow Cytometer (BD Biosciences, East Rutherford, New Jersey) 를 이용하여 녹색 형광 단백질 발현 정도와 TO-PRO로 표지된 polyplex와 polyplex-HA의 세포 내 전달 정도를 측정하였다.

2.7. 세포 독성 실험

세포 배양 조건은 2.4와 동일하나 MTT assay를 진행하기 위해 96-well plate에 세포를 준비했다. Polyplex와 polyplex-HA는 각각 다 섯 가지 농도로 세포에 처리하여 72시간 배양하였다. 세포를 멸균 PBS로 조심스럽게 세척한 후 0.5mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide를 각 well에 20 ul씩 처리해주었다. 인큐 베이터에서 3시간을 추가 배양 후, DMSO를 각 well에 100 ul 첨가해 주고 MTT assay 생성물이 녹을 수 있도록 인큐베이터에서 30분 더 넣어주었다. 이와 같이 완성된 샘플을 EL800 universal plate reader (BIO-TEC Instruments INC, Santa Clara, CA, USA)로 630 nm에서 흡 광을 측정하였다.

2.8. 데이터 정리 및 분석

형광 현미경을 통해 획득한 이미지는 Volocity, 유세포 분석을 통해 획득한 데이터는 FlowJo V10, 그래프를 이용한 데이터 정리는 Origin Pro로 정리했으며, 모든 측정값은 신뢰할 수 있도록 재현성 실험을 5 회 진행했으며 평균값과 표준편차로 나타내었다.

3. 결과 및 고찰

3.1. pDNA PEI, HA 비율 설정

pDNA와 PEI를 1:1, 1:5, 1:7, 1:10의 무게 비율로 섞어주어 polyplex 를 제작했다(각각 N/P 비율 7.5, 37.5, 52.5, 75에 해당). 제작된 polyplex의 크기는 PEI의 비율이 높아질수록 200 nm와 100 nm 사이의 범 위 내에서 점점 작아지는 것을 확인했다[Figure 2(a)]. 이는 PEI 비율 증가로 인해 형성되는 복합체의 개수가 많아지며 PEI의 비율이 낮을 때보다 입자가 분할 생성되기 때문으로 생각한다. 크기 측정 후 동일 한 polyplex를 이용해 MCF7 세포에서 발현을 확인한 결과 1:5의 무게 비율에서 적색 형광 단백질의 형광세기가 가장 강하고 발현된 세포의 개수가 가장 많음을 확인하였다[Figure 2(b)]. 해당 결과를 바탕으로, pDNA와 PEI의 최적 비율을 무게비 1:5로 확정지었다.

다음으로 히알루론 아민 코팅 비율을 최적화하기 위해 polyplex-HA 를 여러 가지 비율로 제작해 비교했다. pDNA:PEI:HA의 무게비를 1:5:5, 1:5:10, 1:5:15, 1:5:20으로 설정했으며 완성된 polyplex-HA 들 의 크기를 측정한 결과 모든 비율에서 polyplex와 비교하여 10 nm 이 내로 증가했고 각각의 비율에 따른 크기 변화의 경향성은 관찰되지 않았으나 1:5:10과 1:5:20에서 PDI 값이 0.03 이하로 표준 편차가 가 장 작은 입자가 생성되었다[Figure 3(a)]. 뿐만 아니라 1:5:10 이상의 비율에서 polyplex-HA의 크기가 103 nm 전후로 비슷하게 측정되는 것으로 보아 1:5:10 에서 코팅이 완료되어 그 이상은 히알루론 아민이 과량 처리 된 것으로 보인다. 동일한 polyplex-HA들을 이용해 MCF7 세포에서 발현을 확인한 결과 1:5:20 보다 1:5:10에서 적색 형광 단백 질의 형광세기가 가장 강하고 발현된 세포의 개수가 많음을 확인하였 다[Figure 3(b)]. 해당 결과를 바탕으로, pDNA:PEI:HA의 최적 비율을 무게비 1:5:10로 결정하였다. 추가적으로, 과량 첨가된 미반응 히알루 론 아민이 히알루론 수용기인 CD44를 포화시켜 오히려 수용체 매개 세포 내 이동을 방해한다고 판단해 20kDa 투과성 막 투석을 통해 미 반응물을 제거하였다.

3.2. 입자의 물리적 특성

입자의 물리적인 특성을 규명하기 위해 앞선 실험에서 정한 비율대 로 제작한 polyplex와 polyplex-HA (투석 전후)의 입자 크기 및 표면 제타 전위를 측정한 결과 polyplex의 크기는 90.54857 ± 0.574977 nm, 제타 전위는 17.769 ± 1.876661 mV로 측정되었다. Polyplex-HA (투 석 전)의 크기는 123.8721 ± 3.023708 nm, 제타 전위는 -28.93 ± 0.66468 mV로, 표면에 히알루론 아민 코팅이 되어 크기 증가가 일어 났으며, 제타 전위가 양(+)에서 음(-)으로 이동된 것으로 보아 음전하 를 띄는 히알루론 아민으로 코팅이 제대로 되었음을 알 수 있다. 또한 polyplex-HA를 투석한 후 역시 149.5879 ± 1.788474 nm로 polyplex 보다 큰 크기에 -27.425 ± 1.251579 mV의 제타 전위를 가지고 있어 투석 과정에서 코팅이 손상되지 않았음을 알 수 있었다[Figure 4(a)].

Polyplex의 pDNA 담지 효율을 측정하기 위해 polyplex를 제작한 뒤 필터로 걸러주고 상층액 속 pDNA의 농도를 NanoDrop™ 2000 [Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)]으로 측정한 결과 본 연구팀이 제작한 polyplex의 pDNA 담지 효율은 72.8%이다. 투과 전 자 현미경을 통해 확인한 polyplex와 polyplex-HA의 모습에서도 polyplex와 달리 polyplex-HA의 표면에 검게 코팅 층이 형성되었음을 확 인했다[Figure 4(b)].

3.3. 세포 실험 및 독성 평가

본 연구팀이 개발한 polyplex-HA의 pDNA 전달 능력을 확인하기 위해 유세포분석기를 통한 정량적인 분석과 형광 현미경을 통한 정성 적인 분석을 진행하였다. 먼저, 정량적인 분석을 위해 유세포분석기로 TO-PRO 형광물질이 표지된 녹색 형광 단백질 pDNA를 이용하여 polyplex와 polyplex-HA의 전달 능력을 검증하였다[Figure 5(a)]. 또한, 동 일한 조건에서 적색 형광 단백질 pDNA를 담지한 polyplex와 polyplex- HA를 형광 현미경을 통해 발현된 적색 형광 단백질 사진을 확보 하였다[Figure 5(b)]. Polyplex와 polyplex-HA는 lipofectamine보다 두 배 이상 높은 전달 효율을 보이는 반면 발현 효율은 그에 미치지 못하 는 것으로 관찰되었다. 그러나 시간에 따라 분석한 결과를 보면, lipofectamine의 경우 녹색 형광 단백질이 24시간에 비해 120시간에서 1/10 수준으로 감소한 반면, polyplex와 polyplex-HA는 1/2 수준으로 감소했다. 막 융합을 통해 세포 내로 전달되는 lipofectamine과 달리 엔도좀 뿐만 아니라 리소좀 단계에서도 PEI의 작용으로 인해 polyplex 에 담지 되어 있던 pDNA가 지속적으로 방출되며 보다 오래 지속되는 효과를 기대할 수 있다.

첨가한 polyplex와 polyplex-HA의 독성을 확인하기 위해 0.2배(10 ng), 0.5배(25 ng), 1배(50 ng), 2배(100 ng), 4배(200 ng)의 총 다섯 가지 양의 입자를 세포에 처리하여 MTT assay를 진행했다[Figure 5(c)]. pDNA 발현 효과를 검증한 50 ng 이하에서는 세포 사멸이 특별히 눈 에 띄지 않으나, polyplex와 polyplex-HA 모두 그 두 배 이상의 입자 를 처리할 시 세포 활성이 80% 이하로 감소해 독성이 존재함을 확인 했다. 해당 결과로 너무 많은 양을 전달하려 할 경우, 세포독성을 일 으킬 수 있지만 적절한 양을 처리한다면, 독성이 없으면서 충분한 pDNA 전달과 발현을 일으킬 수 있다는 것을 확인하였다.

4. 결 론

본 연구는 자가조립을 통한 polyplex 형성과 히알루론 아민 코팅을 통해 pDNA를 효과적으로 전달하고자 했다. 연구를 통해 제안된 polyplex와 polyplex-HA는 pDNA뿐만 아니라 타깃 유전자 침묵화를 위한 siRNA (짧은 간섭 RNA, small interfering RNA) 전달과 타깃 단백질 을 생성을 위한 mRNA (전령 RNA, messenger RNA) 전달에도 사용 될 수 있는 범용적인 기술이다. 또한 항원 단백질에 대한 pDNA 전달 로 인한 체내 항체 생성뿐만 아니라 항체를 직접 생성하는 pDNA 개 발 시 새로운 백신 플랫폼의 기반이 될 수 있다. Polyplex-HA는 음전 하를 띄고 있는 히알루론 아민으로 표면을 코팅함으로써 생체 내의 다양한 단백질이 입자에 흡착되어 유전물질 전달이 저하되는 현상을 방지할 수 있다. Polyplex-HA는 반복 이용 가능한 전달 시스템으로서 바이러스성 벡터와 차별성을 가지며, PEGylation으로 인해 발생 할 수 있는 알레르기성 반응 및 PEG 항체 생성으로 인한 효과 저해 및 면역 과민반응 등을 배제할 수 있는 안전한 전달체이다. 또한, 재료적 특성 을 통해 엔도좀 탈출 효율을 극대화 할 수 있도록 설계되었다는 의의 를 가진다. 그러나 아직 보완 필요한 사항이 존재하여 추가적인 연구 진행이 필요하다. pDNA의 높은 전달 효율에 비해 발현 효율은 그에 미치지 못하는 이유로 pDNA와 PEI의 강한 결합 에너지 탓에 전사 과 정이 제대로 일어나지 못한다는 것으로 예상된다. 따라서 후속 진행 될 연구로 세포 내에서 PEI와 pDNA의 결합이 약화될 수 있도록 삽입 할 추가적인 물질에 대한 탐구가 필요하다.