1. 서 론

최근 들어 건강에 대한 관심이 급증함에 따라 노화방지에 대한 연 구도 활발히 진행되고 있다. 산화와 항산화의 적당한 균형은 생체 건 강에 굉장히 큰 영향을 끼치는데, 현재 알려진 노화의 가장 주요한 원 인으로는 생체 내에서 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 축적이다[1,2]. 인체가 호흡할 때 유입되는 산소는 체내에서 일 부가 ROS로 전환되고 체내에 적정량이 있을 경우엔 이로운 역할을 한다. 하지만 과도한 ROS의 축적은 단백질 변성, 지질 과산화 등을 유 도하는 산화 스트레스를 유발하며 이는 결론적으로 세포 손상과 세포 사를 유발하여 노화를 촉진한다[3,4]. 이러한 현상을 방지하기 위해선 항산화 성분이 많은 플라보노이드를 충분히 섭취하는 것은 도움이 된 다. 대표적인 항산화 물질인 플라보노이드(flavonoids)는 phenylalanine 으로부터 합성되는 식물색소이며, 채소나 과일에서 흔히 보이는 벤조 Y 피론 구조를 특징으로 하는 폴리페놀 화합물의 큰 무리를 구성한다 [5,6]. 플라보노이드는 flavonols, flavan-3-ols, anthocyanins, flavanones, flavones, isoflavones and proanthocyanidins 등의 하위 물질들을 포함 한다[7]. 게다가 플라보노이드는 radical scavengers로써의 높은 약리 활성 때문에 인체의 건강에도 매우 중요하다[8,9]. 천연물 중에서 레 몬그라스는 플라보노이드 함량이 높다고 알려진 물질들 중 하나이다. Lemongrass는 잎과 줄기에서 레몬향이 나며, 주로 citral로 구성되어 있으며 이밖에 α-pinene, camphene, myrcene, limonene 등의 성분들 이 함유되어 있다. 또한 레몬그라스는 해열작용, 진통작용에 탁월하며 최근 항산화 작용에 특히 두각을 나타나는 것으로 보고되었다[10,11]. 따라서 본 연구에서는 lemongrass를 원료로 microwave assisted solvent extraction (MASE) 실험을 진행하여 최적 추출조건을 알아보고 자 하였다. 마이크로웨이브 에너지를 이용하여 플라보노이드를 추출 하기 위한 기초실험을 진행한 후 중심합성계획모델-반응표면분석법 (central composite design-response surface methodology, CCD-RSM) 을 적용하여 최적추출조건을 결정하였다[12]. 추출에 사용된 추출용매 로는 초순수와 95%-주정이고, 주정/초순수 부피비, 마이크로웨이브 조 사시간, 마이크로웨이브 조사세기 등을 변수로 설정하였다.

2. 실험방법

2.1. 마이크로웨이브 에너지를 이용한 플라보노이드 성분의 추출

실험에 사용된 레몬그라스는 푸드믹서로 분쇄하여 건조한 후 추출 용매 250 mL를 기준으로 준비된 12.5 g의 시료를 이용하여 추출공정 을 수행하였다. 추출용매로는 초순수(ultrapure water)와 95%-주정(대 한주정라이프, 95%)을 이용하였으며, 추출공정의 최적화 과정에서 반 응표면분석법의 독립변수로는 주정/초순수 부피비, 마이크로웨이브 조사시간, 마이크로웨이브 조사세기 등을 설정하였다. 기초실험으로 부터 각 독립변수의 최적 추출 범위를 결정한 후 CCD-RSM을 이용하 여 최적화 과정을 수행하였다. 이때 반응치(response)로는 추출된 플 라보노이드 성분의 추출수율과 플라보노이드 함량(total flavonoids)을 선정하였다. 추출된 플라보노이드 성분의 수율은 냉동건조법(freeze drying method)을 이용하여 측정하였다. 레몬그라스로부터 추출된 플 라보노이드 성분은 여과과정 거친 후 진공증류를 통해 농축하여 -10 ℃ 로 6 h 동안 1차 동결한다. 동결된 시료는 냉동건조장치(LP3, Jouan) 에서 0.1 mbar, -40 ℃의 조건으로 24 h 건조한 후 추출수율을 측정하 였다.

2.2. 플라보노이드 함량 분석

레몬그라스로부터 추출된 플라보노이드 성분의 함량 분석은 자외 선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 플라보노이드의 검정곡선을 작 성하기 위해 표준물질로 quercetin (Sigma-Aldrich, Q4951)을 이용하 였으며, 자외선 파장은 415 nm에서 측정하였다[9]. 냉동 건조한 시료 1 mg/mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL와 1 M patassium acetate 0.1 mL를 혼합한 후 메탄올을 이용하여 총부피를 5 mL로 제조하였 다. 제조된 시료는 암실에서 40 min간 방치한 후 자외선 분광광도계를 이용하여 정량하였다. 측정된 흡광도는 검정곡선을 이용하여 quercetin equivalents (μg QE/mL dw)로 환산하였다[13,14].

3. 결과 및 고찰

3.1. 레몬그라스로부터 플라보노이드 성분의 추출

마이크로웨이브 에너지를 이용하여 레몬그라스로부터 플라보노이 드 성분을 추출하기 위한 독립변수를 결정하기 위해 기초실험을 진행 하였다. 본 연구에서는 추출용매의 극성을 조절하기 위해 주정/초순수 부피비, 그리고 추출에너지를 공급하기 위해 마이크로웨이브 조사시 간과 조사세기 등을 독립변수로 설정하였다. 마이크로웨이브 조사시 간 변수범위를 결정하기 위해 마이크로웨이브 조사세기와 주정/초순 수 부피비에 추출용매의 온도변화를 Figure 1에 나타내었다. 주정/초 순수의 부피비 80 vol.%의 조건에서 마이크로웨이브 조사세기가 증가 함에 따라 추출용매의 온도는 증가하였으며, 마이크로웨이브 조사세 기에 관계없이 2.0~4.0 min에서 추출용매의 끓는점인 87 ℃에 도달하 는 것을 알 수 있었다. 또한 마이크로웨이브 조사세기를 700.0 W로 일정하게 조사시키면서 주정/초순수의 부피비에 따른 추출용매의 온 도변화를 실험한 결과 주정이 비율이 감소할수록 혼합용매의 끓는점 인 87~97 ℃까지 상승하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 마이크로웨이브 조사시간 범위를 4.0~10.0 min으로 설정한 후 실험을 진행하였다.

3.2. CCD-RSM을 이용한 추출조건 최적화

본 연구에서 사용된 최적화 도구인 CCD-RSM는 통계학적인 특성과 수학적 기술을 결합하여 여러 조건에 따른 최적화된 공정을 제시한다 [15]. 추출공정에 중요한 독립변수로 고려되는 인자에 대한 CCD-RSM 분석을 위한 독립변수 범위는 주정/초순수의 부피비(50.0~60.0 vol.%), 마이크로웨이브 조사시간(6.0~8.0 min), 마이크로웨이브 조사세기 (500.0~600.0 W)이다. 독립변수에 영향을 받는 반응치(response)는 추 출수율과 플라보노이드 함량을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하 였다. 마이크로웨이브 에너지를 이용한 추출공정에서 최적의 조건을 찾기 위해 CCD-RSM에 따라 설계된 20개의 조건에 대하여 각 실험을 진행하였다. 추출수율, 플라보노이드 함량에 대하여 측정하여 정리된 결과는 Table 1와 같다.

Table 1의 결과를 이용하여 최적화 과정을 진행하면 각 변수에 대 한 회귀식을 얻을 수 있다. CCD-RSM에 따라 설계된 마이크로웨이브 에너지를 이용한 레몬그라스 추출수율에 대한 2차 회귀방정식은 다음 과 같다.

여기서, Y는 추출수율이고, C는 주정/초순수 부피비, t는 마이크로 웨이브 조사시간, W는 마이크로웨이브 조사세기이다. 이러한 회귀방 정식을 통해 변수의 주효과도, 교호효과도, 적합성 결여 등을 판단할 수 있다. 본 연구의 주효과도인 마이크로웨이브 조사시간, 주정/초순 수의 부피비, 마이크로웨이브 조사세기가 반응치에 영향을 끼치는 정 도를 수치화하면 마이크로웨이브 조사시간 : 주정/초순수의 부피비 : 마이크로웨이브 조사세기 = 43.62 : -10.43 : 1.0의 비율로 나타난다. 이 는 마이크로웨이브 조사시간이 0.2 min 증가할 때 추출수율은 0.82% 가 증가하고, 주정/초순수 부피비가 1.0 vol.% 증가할 때 0.98% 감소 하며 마이크로웨이브 조사시간이 10.0 W 증가할 때 추출수율이 0.94% 증가하는 것을 의미한다. 또한 교호효과도인 (마이크로웨이브 조사시 간 × 주정/초순수 부피비) : (조사시간 × 마이크로웨이브 조사세기) : (주정/초순수 부피비 × 마이크로웨이브 조사세기)의 비율은 25.17 : -1.23 : 1.0로 나타났다. 추출수율에 영향을 끼치는 주효과도와 교호효 과도를 같이 고려하였을 때, 마이크로웨이브 조사시간이 추출수율에 가장 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. CCD-RSM을 이용하여 얻 은 회귀식을 이용하여 추출수율에 따른 인자에 대한 영향을 3차원 그 래프와 등고선도를 통하여 Figure 2에 나타내었다. 시간을 일정한 값 으로 고정한 경우, 일정한 마이크로웨이브 조사세기에 대해 주정/초순 수의 부피가 증가할수록 추출수율은 감소하였다. 주정/에탄올의 부피 비와 마이크로웨이브 조사세기 모두 범위내의 중간값을 가질 때 추출 수율도 높은 것으로 나타났다. 주정/초순수의 부피비를 고정한 경우, 마이크로웨이브 조사시간에는 증가하였다가 감소하였으며 주정/초순 수 부피비에는 마찬가지로 증가하였다가 감소하는 경향을 나타내었 다. 마이크로웨이브 조사시간과 주정/초순수 부피비의 추출수율에 대 한 영향 역시 두 인자 모두 중간 값을 가질 때 최대의 추출수율을 갖 는 것으로 나타났다. 마이크로웨이브 조사세기를 고정한 경우, 마이크 로웨이브 조사시간과 주정/초순수의 부피비가 증가할수록 추출수율도 증가하였다.

또한 레몬그라스로부터 추출한 추출물의 플라보노이드 함량에 대 한 반응표면분석에 의한 회귀방정식은 다음과 같다.

여기서, F는 플라보노이드 함량을 의미하며 나머지 인자들은 위의 추출수율의 회귀식과 같은 의미를 갖는다. 플라보노이드 함량의 주효 과도인 마이크로웨이브 조사시간, 주정/초순수의 부피비, 마이크로웨 이브 조사세기가 반응치에 영향을 끼치는 정도를 수치화 하면 마이크 로웨이브 조사시간 : 주정/초순수의 부피비 : 마이크로웨이브 조사세 기 = 13.96 : 13.27 : 1.0의 비율로 나타난다. 이는 마이크로웨이브 조 사시간이 0.2 min 증가할 때 플라보이드 함량이 5.08% 증가하며 주정 /초순수 부피비가 1.0 vol.% 증가할 때 24.13% 증가하고, 마이크로웨 이브 조사세기가 10.0 W 증가할 때 플라보노이드 함량이 18.19% 증 가하는 것을 의미한다. 또한 교호효과도인 (마이크로웨이브 조사시간 × 주정/초순수 부피비) : (마이크로웨이브 조사시간 × 마이크로웨이브 조사세기) : (주정/초순수 부피비 × 마이크로웨이브 조사세기)의 비율 은 -10.61 : 7.30 : 1.0으로 나타났다. 플라보노이드 함량의 경우 주효 과도와 교호효과도를 같이 고려하였을 경우, 추출수율과는 다르게 주 정/초순수 부피비가 플라보노이드 함량에 가장 큰 영향을 끼치는 것 을 알 수 있었다. 반응표면법을 이용하여 얻은 회귀식을 이용하여 플 라보노이드 함량에 따른 인자에 대한 영향을 3차원 그래프와 등고선 도를 통하여 Figure 3에 나타내었다. 마이크로웨이브 조사시간을 고정 한 경우, 주정/초순수의 부피비에는 증가하였으며 마이크로웨이브 조 사세기에는 증가하다가 소폭 감소하는 경향을 보였다. 주정/초순수 부 피비를 고정한 경우에는 시간에 대해서는 계속해서 증가하였으며 반 대로 마이크로웨이브 조사세기에는 반비례하는 경향을 보였다. 마이 크로웨이브 조사세기를 고정한 경우, 마이크로웨이브 조사시간에 따 라서 증가했다가 감소하는 경향을 보인 반면에 주정/초순수의 부피비 에는 큰 변화를 보이지 않았다. 이는 마이크로웨이브 추출에서 마이 크로웨이브 조사세기를 고정시킨 경우에 플라보노이드 함량은 추출 용매의 농도보다 마이크로웨이브 조사시간에 더 많은 영향을 받는 것 으로 해석할 수 있다.

앞서 세 가지 인자(마이크로웨이브 조사시간, 주정/초순수 부피비, 마 이크로웨이브 조사세기)에 따른 두 가지 요인(추출수율, 플라보노이드 함량)에 대한 회귀식을 각각 얻었으며, 그에 따른 표면도를 3차원 그 래프와 등고선도로 나타내었다. 최종적으로 인자에 따른 요인에 대한 최적화를 하고자 한다. 추출수율과 플라보노이드 함량 모두 최대값을 가질 수 있는 세 가지 인자에 대한 최적 조건 그래프를 Figure 4에 나 타내었다. CCD-RSM을 이용한 최적화 결과 레몬그라스 마이크로웨 이브-용매 추출의 최적조건은 마이크로웨이브 조사시간 6.1 min, 주정 /초순수 부피비 56.3 vol.%, 마이크로웨이브 조사세기 574.6 W로 나 타났다. 이 조건으로부터 예상되는 요인의 값은 추출수율 17.2%, 플라 보노이드 함량 44.7 μg QE/mL dw으로 나타났다. CCD-RSM 분석 결 과 본 연구에서의 종합만족도 D = 0.8562이고 그 유의성은 5% 이내 에 수준에서 나타났다.

4. 결 론

본 연구에서는 마이크로웨이브 에너지를 이용하여 항산화능 및 플 라보노이드 성분이 포함된 레몬그라스로부터 플라보노이드 성분을 추 출하기 위한 최적추출조건을 CCD-RSM으로 산출한 결과 다음과 같 은 결론을 얻을 수 있었다.