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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)

Applied Chemistry for Engineering Vol.32 No.1 pp.1-9
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2020.1094

Development of Fluorescent Small Molecules for Imaging of Alzheimer’s Disease Biomarkers

Changho Min, Heonsu Ha, Jongho Jeon†

Department of Applied Chemistry, School of Applied Chemical Engineering, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republic of Korea

These authors contributed equally to this paper.

^†Corresponding Author: Kyungpook National University, Department of Applied Chemistry, School of Applied Chemical Engineering,
Daegu 41566, Republic of Korea Tel: +82-53-950-5584 e-mail: jeonj@knu.ac.kr

Received November 11, 2020 ; Review November 25, 2020 ; Accepted December 26, 2020

Abstract

Alzheimer’s disease (AD), an irreversible degenerative disorder, is associated with accumulation and aggregation of amyloid-β peptides, hyperphosphorylated tau proteins, and high level of metal ions in the brain. Up to date, there is no effective therapeutic agent to stop the progress of the disease and thus early and accurate diagnosis of AD has gained increasing attention in recent years. Among several diagnostic methods, an optical imaging using fluorescent probes is one of the most promising tools to visualize AD biomarkers. In this review, we will introduce fluorescent probes that can be applied to in vivo brain imaging of AD models and also their structure. It is expected that the present review will provide useful information to many scientists in the related research fields.

Key Words : Alzheimer’s disease , Diagnosis , Fluorescent probes , Biomarkers , Molecular imaging

알츠하이머병의 영상 진단을 위한 형광 프로브의 개발

민 창호, 하 헌수, 전 종호†

경북대학교 공과대학 응용화학공학부 응용화학과

초록

알츠하이머병은 신경퇴행질환으로 뇌조직에서 발생하는 아밀로이드 베타(amyloid-β, Aβ) 펩타이드의 축적과 응집, 타 우 단백질의 초인산화, 고농도의 특정 금속이온 축적에 의해 발병하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 효과적인 치료제 가 개발되지 못하였기 때문에, 알츠하이머병을 초기에 정확하게 진단하는 기술은 매우 중요하다. 알츠하이머병의 진단 을 위해 개발된 다양한 기법 중 형광 프로브를 이용한 알츠하이머병의 바이오마커 영상화는 많은 연구자들의 관심을 받고 있다. 본 리뷰 논문에서는 최근 개발된 알츠하이머병 진단용 형광 프로브의 구조와, 체내 뇌 영상화에의 적용을 소개하고자 한다. 본 논문은 향후 새로운 프로브를 개발하고자 하는 연구자들에게 많은 도움이 될 것으로 기대된다.

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Funding:

1. 서 론

알츠하이머병(Alzheimer’s disease)은 치매를 일으키는 퇴행성 뇌질 환으로 인지 기능 이상 및 기억력 저하 같은 신경학적 증상뿐만 아니 라 다양한 신체적인 합병증까지 유발하는 것으로 알려져 있다. 알츠 하이머병은 환자뿐만 아니라 가족에게 정신적, 신체적, 경제적 부담을 초래할 뿐만 아니라 질병에 대응하기 위한 사회경제적인 비용도 크게 증가시킨다. 그 동안 많은 연구자들에 의해 알츠하이머병 치료제 개 발을 위한 노력이 꾸준히 진행되었고 그 결과 도네페질(donepezil), 리 바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine), 타크린(tacrine)과 메 만틴(memantine) 이렇게 다섯 가지 약물이 미국 FDA에 의해 치료제 로 승인되었다. 하지만 이러한 의약품들은 증상을 일시적으로 완화시 킬 뿐 알츠하이머 병의 진행과정을 멈추게 하거나 질병 자체를 근원 적으로 치료하지는 못한다. 그 이유 중 하나는 중증 환자의 대부분이 이미 알츠하이머병이 오랜 기간 진행된 후 치료를 시도하기 때문이다. 따라서 알츠하이머병을 조기에 정확하게 진단하는 기술은 질병의 효 율적인 관리 및 증상완화를 위해 매우 중요하다.

지난 수십 년간 magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT) 등 다양한 분자 영상 기법이 뇌 질환의 진단에 적용되었다. 그중 형광 프로브를 활용한 광학 영상 은 고가의 의료장비 및 방사선을 기반으로 한 진단 방법에 비해 비교 적 낮은 비용으로 영상 연구를 수행할 수 있으며, 질환 동물 모델 및 세포에서 높은 민감도의 실시간 영상을 얻을 수 있다는 장점을 갖고 있다. 최근 광학 영상의 최대 단점인 체내에서의 낮은 신호 투과도 (weak penetration depth)와 자가 형광(autofluorescence) 문제를 해결하 기 위하여 근적외선(near infrared, NIR) 영역에서 신호를 방출하는 형 광 프로브의 개발이 활발하게 진행되어 왔다. 그중 몇몇 형광 물질은 알츠하이머병의 주요 바이오마커인 아밀로이드 베타(amyloid beta, A β) 및 타우 얽힘(tau tangle)과 높은 친화도를 갖는 것으로 알려져 있으 며, 이러한 특성을 활용하여 알츠하이머 동물 모델의 뇌 영상 연구와 기초 의학 연구에 매우 유용하게 적용될 수 있는 프로브의 개발로 이 어졌다. 지난 수년간 많은 학자들은 이러한 형광 물질을 활용하여 분 자 수준에서 알츠하이머병의 발병 및 진행 메커니즘 연구와 더불어 치료제의 개발과 후보물질의 효능 평가 연구를 수행해 왔다. 본 리뷰 논문에서는 근적외선 영역에서 광학 신호를 방출하는 형광 프로브와 알츠하이머병의 바이오마커(Aβ, tau tangle 등)의 실시간 생체 영상에 적용한 최근 연구들을 소개하고 관련 분야에 대한 향후 전망을 제시 하고자 한다.

2. 알츠하이머병 바이오마커의 형성과정

2.1. Amyloid-β (Aβ)

응집된 형태의 amyloid-β (Aβ aggregate)는 알츠하이머 질병의 가장 핵심적인 병리학적 마커로 알려져 있다. 따라서 Aβ aggregate를 효율 적으로 검출하는 것은 알츠하이머병의 근본적인 원인을 밝혀내고 질 병을 정확하게 진단하는 데 있어 매우 중요하고 할 수 있다[1,2]. 이러 한 Aβ는 amyloid 전구 단백질(APP)의 분해로부터 생성된다(Figure 1). APP는 β-secretase에 의해 분해되어 APPsβ와 막관통 단백질 부분인 β -stub를 생성한다. 이어서 β-stub는 γ-secretase에 의해 분해되어 Aβ 펩 타이드 단량체(monomer)를 형성한다(Figure 1a)[3,4]. Aβ 단량체는 서 로 응집하여 크기가 증가하고 점점 복잡한 구조를 갖는 올리고머 (oligomer), 섬유(fibril), 플라크(plaque)를 생성하게 된다(Figure 1b)[5]. 특히, 올리고머 형태의 Aβ는 플라크 응집체 보다 높은 신경 독성을 갖고 있으며 뇌 조직의 다양한 신호 전달 체계 및 염증 반응에도 영향 을 주는 것으로 알려져 있다.

2.2. Neurofibrillary tangles (NFTs)

Amyloid-β 이외에 중요한 바이오마커로 거론되고 있는 것이 신경 섬유 얽힘(neurofibrillary tangles, NFTs)이다[6]. 신경 섬유의 얽힘 현상 은 타우 단백질(tau protein)의 초인산화(hyperphosphorylated)로 인해 발생한다. 보통 타우 단백질은 신경세포 내에서 미세소관(microtuble) 들을 안정화하는 역할을 하고 있으나, 신경 퇴화 과정에서 타우 단백 질이 미세소관에서 떨어지게 되면서 세포 내에서 인산화(phosphoryla- tion), 가수분해(proteolysis), 당질화(glycosylation)와 같은 변형이 발생 한다. 이때 생성되는 초인산화 타우 단백질(hyperphosphorylated tau protein, p-Tau)은 미세소관에 대한 결합력을 상실하여 분해되고 tau aggregate를 생성하게 된다(Figure 2)[7]. 이는 NFTs의 생성으로 이어 지게 되며, 이로 인해 체내 세포 수송 시스템이 영향을 받아 결과적으 로 신경세포가 사멸한다[8]. 알츠하이머 환자의 뇌에서는 kinases와 phosphatase의 불균형으로 인해 초인산화 타우 단백질이 정상 뇌 조직 에 비해 4~8배 많이 형성된다고 알려져 있다[9].

3. 프로브 개발의 역사

19세기에 congo red (CR)가 뇌 조직에서 Aβ 플라크를 검출할 수 있 는 염색 시약으로 활용될 수 있음이 밝혀졌다(Figure 3a)[10,11]. CR은 sulfonate (-SO₃H) 그룹을 포함하고 있는 아조 화합물로서 친수성이며 Aβ 플라크에 대한 결합력을 갖고 있는 물질이다. 그러나 뇌혈관장벽 (blood-brain barrier, BBB)에 대한 투과성이 상당히 낮기 때문에 생체 내에서 비 침습적 영상에는 활용되지 못하였다. 이후 thioflavin T (ThT)[12], Methoxy-X04[13], AOI-987[14] 같은 다양한 양이온성 분 자 구조를 합성하여 이를 보완하고자 하였으나 이 물질들은 Aβ 플라 크에 대한 결합력이 낮고 뇌에서 배출 속도가 느린 점 등의 단점을 갖고 있었기 때문에 생체 영상에 널리 활용되지는 못하였다(Figure 3b~d). 이후 전하(charge)를 갖지 않는 Pittsburgh compound B (PiB)가 개발되 어 이러한 알츠하이머병 뇌 영상에 획기적인 발전을 가져오는 계기가 되었다(Figure 3e)[15,16]. PiB는 앞서 활용된 프로브에 비해 Aβ 플라 크에 대한 결합력과 BBB 투과성 및 배출 속도가 향상된 결과를 보였 다. 현재 PiB는 방사성동위원소([¹¹C]CH₃)로 표지하여 임상 및 기초 연구 PET 영상에 활발하게 활용되고 있다. 또한 PiB를 기초로 한 다 양한 유도체들이 합성되어 진단용 의약품 개발에 기여하였다. 이후 많 은 연구자들은 다양한 종류의 분자 구조를 연구하여 새로운 특성(근 적외선 영역에서 형광 신호 방출, 높은 선택성, Aβ 플라크 결합 시 형 광의 세기의 증가 등)을 가진 프로브의 개발을 통하여 뇌 영상 연구에 활용하고자 하였다[17].

신경 섬유 얽힘의 형성은 앞서 소개하였듯이 초인산화 타우 단백질 과 관련이 있기 때문에 타우 단백질을 검출하는 방향으로 프로브 개 발 연구가 진행되었다[18]. 구체적으로 타우 단백질의 영상화를 위하여 (i) tau aggregate 사이로 삽입될 수 있는 프로브의 개발과 (ii) 메탈 이 온을 포함한 양이온 분자를 합성하여 p-tau aggregate의 인산기(phosphate group, -PO₄H)와 정전기적 결합이 가능한 프로브의 개발 이렇 게 크게 두 가지 방향으로 연구가 진행되었다. 하지만, p-tau aggregate 에 대한 프로브는 Aβ 검출을 위한 프로브 보다 상대적으로 적다. 그 이유는 프로브가 p-tau aggregate와 결합하는 메커니즘이 뚜렷하게 제 시되지 않아서 p-tau aggregate에 대한 높은 결합력과 Aβ aggregate와 p-tau aggregate를 구별할 수 있는 선택성을 가진 프로브의 개발이 쉽 지 않기 때문이다. 현재까지 연구된 p-tau aggregate 검출을 위한 프로 브는 Aβ aggregate 영상 프로브와 유사한 구조로 개발되었고, 이 중 p-tau aggregate와 결합력이 더 높은 분자구조를 찾기 위하여 랜덤 스 크리닝 방법(random screening method)이 활용되었다. 이러한 연구 결 과, 프로브의 전자 주개(electron donor)와 받개(electron acceptor) 사이 의 거리가 13~19 Å이면 p-tau aggregate에 대해 선택성이 높고, 이보 다 짧은 거리를 가진 프로브는 Aβ aggregate에 대해 선택성이 높다는 것이 보고되었으며, 비슷한 구조를 가진 프로브에서는 다중 고리 형 태를 갖고 있는 것이 타우 단백질에 대해 비교적 높은 선택성을 보이 는 것이 알려졌다[19].

4. 알츠하이머병의 바이오마커 영상화를 위한 형광 프로브의 개발 및 활용

4.1. Dithiophene 구조 기반 프로브

Dithiophene 구조를 갖고 있는 NIAD-4는 Aβ 플라크를 영상화를 위 해 합성된 초기 근적외선 프로브 중 하나이다(Figure 4a)[20]. NIAD-4는 Aβ에 대해 강한 결합력을 보여주었으며(K_i = 10 nM), Aβ aggregate와 결합 시 형광 세기가 약 400배 이상 크게 증가하는 특징을 갖고 있다. 동물 모델에 NIAD-4를 정맥 주사한 결과 BBB를 통과하여 Aβ 플라 크를 영상화하는데 성공하였다. 하지만 Aβ 플라크 영상은 두개골을 절개해서 관찰한 것이기 때문에 실제 알츠하이머 진단에 사용하기에 는 실용적이지 못하다. 이후 Bacskai에 의해 NIAD-4의 구조를 기반으 로 하여 NIAD-11과 NIAD-16이 합성되었다(Figure 4b,c) [21]. 두 프 로브는 모두 700 nm 이상의 영역에서 형광 방출 파장을 보여줌으로 써 생체 영상에 적합하게 활용될 수 있는 가능성을 보였다.

4.2. Cyanine 구조 기반 프로브

4.2.1. Aβ 플라크 영상 연구

Cyanine 구조의 염료는 특정 분자의 형광 표지에 활용되며 기초 연 구 및 의학 영상 분야에 널리 사용되고 있다. 대표적인 근적외선 프로 브의 예시로 IR-780 (Figure 5a), indocyanine green (ICG) 등이 있다 [22]. 하지만, 근적외선 영역에서 형광을 나타내는 cyanine 유도체들은 BBB 투과성이 낮아 알츠하이머병의 바이오마커 영상화를 위한 프로 브로 활용되지는 않았다. 2016년에 Yi 연구팀은 aminonaphthalene 2-cyanoacrylate (ANCA)와 spiropyran (SP)을 연결한 AN-SP 프로브를 개발하였다(Figure 5b). AN-SP는 PBS에서 557, 701 nm에서 두 가지 형광 방출 파장을 나타냈다. 또한, Aβ 단량체나 섬유질에는 양자수율 (quantum yield, QY)의 변동이 없었지만 Aβ oligomer와 반응 시 QY 가 0.98%에서 16.3%로 크게 증가하는 결과를 나타냈다[23]. 또한 AN-SP는 Aβ oligomer에 대하여 높은 결합력(K_d = 1.7 μM)을 보였는 데 이는 Aβ oligomer의 소수성 부분과 AN-SP에서 SP 부분의 π-π 상 호작용으로 인해 강한 결합을 형성할 수 있기 때문이다. 알츠하이머 병 동물 모델인 triple Tg mice에 대하여 프로브를 주입하여 12 h 후 관찰한 결과 in vivo와 ex vivo 영상 모두 뇌 조직에서 플라크 모양을 갖는 형광 이미지가 관찰되었다. 이러한 결과가 정상 동물 모델(wild type mice)에는 나타나지 않은 것으로 보아 AN-SP는 생체 내 Aβ oligomer 영상화에 활용될 수 있는 가능성을 보였다. 2017년에 Aβ aggregate를 검출하기 위한 cyanine 유도체인 MC-1이 보고되었다(Figure 5c). MC-1은 IR-780 구조에서 양전하를 나타내는 부분을 전기적 중성 을 갖도록 다른 구조로 대체하여 만들어졌다. MC-1은 695 nm의 방출 파장과 Aβ aggregate에 대해 높은 결합력을 보여주었으며(K_d = 59.09 nM), ex vivo 실험에서 APP/PS1 쥐의 뇌 조직에 있는 Aβ aggregate를 염색할 수 있었다. 알츠하이머병을 앓는 14 months 쥐를 대상으로 수 행한 in vivo 뇌 영상에서도 정상 쥐에 비해 높은 형광 신호를 나타냈 다[24]. 2019년 Kong 연구팀이 개발한 ZT-1 (Figure 5d)은 MC-1보다 더 긴 방출 파장을 나타냈다(λ_max = 752 nm). 또한, ZT-1은 MC-1과 비교하였을 때, in vivo와 in vitro 모두 Aβ aggregate에 대하여 더욱 높은 선택성을 갖고 있는 것으로 보고되었다.[25] 그러나 결합력은 MC-1보다는 낮았기 때문에(K_d = 445 nM) 향후 효과적인 영상화를 위 하여 최적화된 프로브 구조를 개발할 필요가 있다.

4.2.2. Tau tangle 영상 연구

2013년도에 Bai 연구팀은 처음으로 근적외선 영역에서 형광을 내 며 tau aggregate를 검출할 수 있는 ratiometric 프로브인 CyDPA2를 개 발하였다(Figure 6). CyDPA2는 indocyanine green구조에 tau aggregate 의 인산화 된 부분과 결합할 수 있도록 zinc dipicolylamine (DPA-Zn) 를 결합하여 합성되었다. CyDPA2는 두 개의 DPA-Zn(II) 구조가 tau aggregate의 인산화기와 복합체를 형성하여 높은 결합력을 보이며 (EC₅₀ = 0.304 μg/mL), 840 nm에서 형광 방출 파장을 나타낸다. 이 프로브는 인산화 된 타우 단백질과 결합 시 810과 710 nm의 흡수 파 장의 비(Abs 810/Abs 710 nm)가 17% 증가하였고 인산화가 되지 않은 일반 타우 단백질과 결합 시에는 25% 감소하는 결과를 나타냈다. 하 지만, Aβ가 존재하는 환경에서 타우 단백질과 결합 특이성에 대해서 는 보고 하지 않았기 때문에 알츠하이머병 동물 모델에 적용하기 위 해서는 추가적인 연구가 필요하다[26].

4.3. Curcumin 유도체 기반 프로브

4.3.1. Aβ 플라크 영상 연구

Curcumin은 항암, 항산화, 항염증 등 다양한 생물학적 활성을 갖고 있는 천연물로 알려져 있다. Curcumin은 다양한 in vitro 및 동물 모델 을 활용한 in vivo 연구에서 Aβ 플라크를 감소시킨다는 연구결과가 있지만 낮은 BBB 투과성, 짧은 형광 방출 파장, 빠른 대사 속도 등의 한계점으로 인해 진단용 프로브로는 널리 활용되지 못하였다[27]. 2009 년, Ran 연구팀은 N,N’-dimethyl group과 2,2-difluoro-1,3-dioxaborines 이 포함된 curcumin 유도체인 CRANAD-2를 개발하였다(Figure 7a). CRANAD-2는 Aβ 플라크와 결합 후 715 nm의 형광 방출 파장과 높 은 감도(70배 형광 증가), 그리고 K_d = 38.69 nM의 결합력을 나타냈 다. 하지만, CRANAD-2는 단량체나 oligomer 형태의 Aβ를 검출하지 못하며, 배출되는 속도가 느리다(brain 2 min/brain 30 min = 2.4)는 단 점을 갖고 있다[28]. 2013년, Ran 연구팀은 CRANAD-2의 두 벤젠고 리 중 하나를 pyridine으로 치환하여 친수성을 높인 CRANAD-58을 개발하였다(Figure 7b). CRANAD-58은 가용성과 불용성 Aβ 모두 검 출할 수 있었으며 Aβ40과 Aβ42 단량체에 대하여 각각 K_d = 105.8 nM, 45.8 nM의 결합력을 나타내었다. 또한, 생체 형광 영상 실험에서 정상 동물 모델(WT mice)과 4 months 된 알츠하이머 모델(APP/PS1 mice)을 구분할 수 있었다[29]. 이후 2015년에 같은 연구팀은 Aβ에 대 한 결합력을 향상시키기 위하여 CRANAD-2의 모든 벤젠 고리를 pyridine으로 치환한 CRANAD-3를 개발하였다(Figure 7c). Pyridyl 고리 에 존재하는 질소 원자와 Aβ 간의 수소 결합으로 인해 Aβ monomer (단량체), dimer, oligomer에 대해 모두 결합력이 증가하였으나 형광 방출 파장은 이전 프로브에 비해 크게 감소하는 결과를 나타냈다(λ_em = 730 nm)[30].

2017년 Ran 연구팀은 CRANAD-3 골격에 부피가 큰 phenoxy-alkyl 기를 도입하여 새로운 구조의 CRANAD-102를 개발하였다(Figure 7d). CRANAD-102는 Aβ40 aggregate (K_d = 505.9 ± 275.9 nM)보다 Aβ42 oligomer (K_d = 7.5 ± 10 nM)에 대한 결합력이 더욱 높다. 또한, Aβ 단량체나 dimer와 결합하였을 때 oligomer나 aggregate와 결합하였을 때보다 더욱 강한 형광 신호를 나타냈다. 이러한 특성 외에도 CRANAD-102는 높은 BBB 투과성 및 화학적 안전성을 보유하고 있 어 쥐의 혈장에서도 비교적 안정한 상태로 존재할 수 있다. 생체 영상 실험에서 5 months APP/PS1 mice와 WT mice에게 각각 정맥주사를 놓은 뒤 30 min 후 근적외선 영상을 비교한 결과, 알츠하이머 모델의 뇌에서 형광 세기가 더욱 강한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들 을 통해 CRANAD-102는 가용성 Aβ의 변화를 정량적으로 검출할 수 있을 것으로 예상된다[31].

4.3.2. Tau tangle 영상 연구

2015년에 Chong 연구팀은 타우 단백질을 검출할 수 있는 curcumin 유도체 프로브를 합성하였다(Figure 8). 먼저 1c는 K_d = 0.77 μM 정도 의 결합력을 갖고 있으며 Tau-GFP-transfected SHSY-5Y 세포 내에서 tau aggregates를 검출할 수 있었다[32]. 하지만, 1c는 620 nm의 형광 방출 파장과 낮은 선택성(Aβ aggregates에 높은 결합력)으로 인해 생 체 내 타우 단백질을 영상화 하는 프로브로 사용되기에는 한계가 있다. 이후 타우 단백질에 대한 선택성을 높이기 위해 3,5-dimethoxy-N,N- dimethylanilin- 4-yl 구조를 갖고 있는 3h를 개발하였다. 3h는 tau aggregate에 대한 선택성이 Aβ aggregates에 대한 선택성보다 3.8배 정 도 높으며 650 nm의 형광 방출 파장을 갖고 있다[33].

2017년도에 같은 연구팀에서는 기존 프로브를 최적화하여 3h의 에 스터 부분을 방향족 케톤으로 치환시켜 물질의 안정성을 증가시킨 2c 를 개발하였다. 2c의 형광 방출 파장은 690 nm이며 tau aggregate에 대한 선택성은 Aβ 섬유질과 BSA에 비하여 각각 10.3, 19.5배 높은 결 과를 나타냈다. 세포 실험에서 2c는 신경 모세포 내에 존재하는 tau aggregate를 염색하는 것이 가능하였다[34]. 또한 Chong 연구팀은 치 환된 difluoroboron β-diketonate과 N,N-dimethylaniline 작용기를 포함 하고 있는 형광 염료를 보고하였다. 프로브 2e는 690 nm에서 형광이 방출되며 tau aggregate에 대한 선택성은 Aβ 섬유질과 BSA에 비하여 각각 8.8, 6.2배 높은 결과를 나타냈다. 또한, 2e를 활용하여 알츠하이 머 환자 뇌 환자 조직에서 항체를 활용한 tau aggregate를 검출한 결과 와 거의 유사한 위치를 염색할 수 있었다[35].

4.4. BODIPY 유도체 기반 프로브

4.4.1. Aβ 플라크 영상 연구

BODIPY (Boron-dipyrromethene) 염료는 우수한 형광 특성과 유도 체를 합성하기 쉬운 장점으로 인해 Aβ aggregate를 검출을 위한 새로 운 종류의 형광 프로브로 연구되었다[36]. 2013년, Ono 연구팀은 BODIPY 구조에 thiophene 그룹을 도입한 BAP-2를 개발하였다(Figure 9a)[37]. BAP-2는 근적외선 영역인 708 nm에서 형광 방출 파장을 갖 고 있으며 Aβ aggregate와 높은 결합력을 나타내었다(K_d = 55 nM). Chang 연구팀은 phenol 구조를 포함하고 있는 BD-Oligo를 합성하였 다(Figure 9b). BD-Oligo를 활용하여 선택적으로 Aβ oligomer를 검출 하는 연구를 진행한 결과 Aβ oligomer의 소수성 부분과 프로브 간의 π-π 상호작용으로 인해 다른 Aβ 단량체나 섬유질(fibrils)보다 Aβ oligomer와 더욱 강하게 결합(K_d = 0.48 μM)한다는 것을 밝혔다. 최대 방출 파장은 604 nm이며 Aβ oligomer와 결합하였을 경우 580 nm로 blue-shift 된다. BD-Oligo를 18 months 된 APP/PS1 mice에 복막 주사 를 통해 주입하고 난 후 형광 영상을 관찰하였을 때, BBB에 대한 투 과성과 Aβ 검출이 가능한 것을 확인하였다. 특이한 점은 형광 신호가 나타나는 부위가 Aβ 플라크뿐만 아니라 주변 부분에서도 나타나는데 이것은 Aβ oligomer인 것으로 예상된다[38].

이후 Hu 연구팀에서 새로운 BODIPY 프로브인 QAD-1을 개발하였 다(Figure 9c). QAD-1은 BODIPY 구조와 함께 형광 신호를 감소 (quenching)시킬 수 있는 작용기인 tetrahydro-quinoxaline를 포함하여 Aβ 영상을 위하여 광유발 전자전이(photo-induced electron transfer) 메커니즘을 활용하였다[39]. 즉, QAD-1이 바이오마커와 결합할 경우, BODIPY와 tetrahydro-quinoxaline의 거리가 변하면서 형광이 나타나게 된다. QAD-1은 낮은 배경 신호(background signal)와 Aβ aggregate에 대해 K_d = 27 nM의 좋은 결합력을 갖고 있다. 특히 QAD-1의 낮은 배경 신호는 in vitro에서 세척 과정을 거치지 않아도 조직에서 Aβ aggregate 염색이 가능하도록 해준다. In vivo에서는 6 months APP/ PS1 mice를 활용한 형광 영상에 활용되었다.

4.4.2. Tau tangle 영상 연구

2017년 Kim 연구팀은 BAP-1의 구조를 기반으로 tau aggregate를 검 출하기 위한 BODIPY 유도체 프로브인 Tau 1, 2를 개발하였다(Figure 10). Tau 1과 2 모두 큰 large stoke shift와 긴 방출 파장 등 뛰어난 광 물리학적 특성을 보였으며(Tau 1: 733 nm, Tau 2: 712 nm) tau aggregate에 대한 높은 선택성을 보여주었다. 또한, Tau 1과 2는 타우 얽힘 과 결합하여 형광 신호가 각각 6.4 그리고 9.3배 증가한 반면, Aβ aggregate 존재 하에서는 형광이 증가하지 않았다. 이러한 특성을 활용 하여 Tau 1은 뇌 조직에서 tau aggregates를 특이적으로 검출할 수 있 었다. 생체 영상 실험에서 15 months 된 3xTg mice 모델의 tau aggregate를 성공적으로 영상화 할 수 있었다[40].

4.5. Carbazole 유도체 기반 프로브

4.4.1. Aβ 플라크 영상 연구

2012년, Wong 연구팀은 carbazole 구조를 기반으로 한 형광 프로브 인 SLOH를 합성하였다(Figure 11a). SLOH는 Aβ aggregate에 결합하 여 형광의 세기가 크게 증가(> 80배)하는 특성을 갖고 있을 뿐만 아니 라 Aβ 펩타이드의 뭉침 현상을 형성을 억제하는 기능도 있는 것으로 보고되었다[41]. 2016년 같은 연구팀에서 dibutylaniline 그룹을 포함하 고 있는 새로운 SLOH 유도체인 DBA-SLOH를 개발하였다(Figure 11b). DBA-SLOH는 quinolinium에 양전하를 갖고 있지만 aniline 그룹에 있 는 지용성의 alkyl chain의 영향으로 BBB를 투과할 수 있으며 형광 방 출 파장은 672 nm이다. 또한, DBA-SLOH는 Aβ40과 Aβ42 peptide로 부터 Aβ oligomer의 형성을 억제할 수 있음이 알려져 알츠하이머병의 치료제로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 생체 영상 실험에서 DBA-SLOH를 활용하여 6, 12 months APP/PS1 mice의 뇌 영상 연구를 성공적으로 수행할 수 있었다. 하지만 DBA-SLOH는 Aβ aggregate에 대한 결합력이 낮다는 단점이 있다(K_d = 1.13 μM)[42]. 이후 2018년에 quinolinium과 cyanine을 기반으로 한 SLM이 소개되었다(Figure 11c). SLM은 677 nm의 최대 방출 파장을 보유하고 있으며 Aβ aggregate와 결합 시 형광의 세기가 증가하는 특징이 있다. 생체 영상에서 9 months APP/PS1 mice와 WT mice를 비교하여 SLM이 Aβ종을 검출할 수 있 다는 것을 확인하였다. 하지만 SLM 또한 Aβ aggregate에 대한 결합력 이 상당히 낮다는 단점이 있다(K_d = 13.1 μM)[43].

4.5. Dicyanomethylene 유도체 기반 프로브

4.4.1. Aβ 플라크 영상 연구

2014년, Cui 연구팀은 방향족 고리인 N,N-dimethylaminophenyl를 전 자 주개로, dicyanomethylene을 전자 받개로 이용한 DANIR을 합성하 였다(Figure 12). 이 중, DANIR 2c은 Aβ aggregate에 대하여 좋은 결 합력(K_d = 26.9 nM)을 갖고 있다. DANIR 2c가 Aβ aggregate와 결합 하게 되면 blue-shift로 인해 방출 파장은 665 nm에서 625 nm로 감소 하나 형광 신호의 강도는 12배 증가한다. 동물 실험에서 22 months APP/PS1 mice와 WT mice를 정맥주사 30 min 후 비교하였을 때, 질 환 모델 동물의 뇌에서 형광 신호가 훨씬 강한 결과를 나타났으며 Aβ aggregate 검출 가능성을 보여주었다[44]. DANIR 3c는 DANIR 2c의 구조에서 dimethylaminophenyl 부분을 dimethylaminonaphthyl 작용기 로 바꾸어 더욱 긴 형광 방출 파장을 갖도록 하였다(λ_em = 678 nm) [45]. 또한, DANIR 3c는 DANIR 2c보다 Aβ aggregate에 대하여 더욱 좋은 결합력을 보유하였다(K_d = 1.9 nM). 하지만, naphthalene 고리로 인해 지용성이 증가하였고(logP of DANIR 2c = 3.37, logP of DANIR 3c = 4.56), 이로 인해 뇌 조직에서 배출 속도가 감소하는 단점이 발생하 였다[DANIR 3c (brain 2 min/brain 30 min) = 5.6 and DANIR 2c (brain 2 min/brain 30 min) = 3.3]. 이는 형광영상에서 바람직하지 않은 높은 배경신호(background signal)의 요인이 된다. 이후 Cui 연구팀에서 프 로브의 친수성을 높이고, 바이오마커와 결합하지 않는 프로브의 배출 속도는 증가시키기 위하여 새로운 구조를 갖는 DANIR 8c와 Probe 12d를 설계하였다[46,47]. 특히, DANIR 8c는 in vivo에서 Aβ aggregates와 결합하게 되면 형광의 세기가 매우 강해졌으며(629 배 증가), blue shift가 크게 일어난다(λ_em = 798 nm → 678 nm). 또한, DANIR 3c와 비교하였을 때, 뇌에서 약동학적인 특성이 향상되었다. Probe 12d는 Aβ aggregate와 결합력이 높으며(K_d = 7.3 nM) 근적외선 영역 의 빛을 방출한다(λ_em = 715 nm). 또한 기존 소수성 프로브에 비해 배 출 속도가 상당히 향상되었다. 2019년, Cui 연구팀은 Aβ aggregate와 인산화된 tau 단백질에 모두 결합력이 높은 프로브인 DADNIR 2를 설계하였다(각각, K_d = 1.04 nM, K_d = 0.41 nM). 이후 질환 동물 모델 (APPswe/PSEN1 mice)에서 실험을 수행한 결과 두 바이오마커 모두 영상화하는데 성공하였다[48]. 하지만 이 프로브는 Aβ aggregate와 tau protein을 구분하는 능력은 떨어진다는 단점을 보유하고 있었다. 이러 한 한계점을 극복하고자 두 바이오마커를 구분할 수 있는 Probe 18을 개발하였고, Ooshika-Lippert-Mataga (OLM) 방정식을 사용하여 바이 오마커의 유전율(ε₀, permittivity)에 따라 프로브와 결합 시 발생하는 상호작용 정도의 차이를 통해 바이오마커를 구분하는데 성공하였다(ε₀ of Aβ aggregates = 2.89 and ε₀ of tau protein = 3.96)[49]. 실제로 probe 18은 Aβ aggregate, tau protein과 결합하였을 때 각각 다른 형광 방출 스펙트럼을 나타내는 것으로 보고되었다.

Table 1에 본 논문에서 소개한 형광 프로브의 종류와 물리적 특성 을 요약하였다.

5. 결 론

뇌 영상은 알츠하이머병을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 가장 좋은 방법 중 하나이다. 본 리뷰 논문에서 알츠하이머병의 바이오마 커(Aβ, tau tangle)를 검출하기 위한 다양한 종류의 형광 프로브의 개 발과 활용 연구를 살펴보았다. 실제로 형광 영상 기법을 활용하여 사 람을 대상으로 하는 임상에서 알츠하이머병을 진단하기 위해서는 여 전히 기술적인 한계가 존재한다. 그러나 현재까지 개발된 몇몇 형광 프로브는 질환 동물모델에서 알츠하이머병의 영상 진단 연구와 더불 어 병리학적 기전 연구에 적합하게 활용될 수 있었다. 그동안 많은 연 구자들의 오랜 노력으로 인해 동물 모델에서 전임상 연구에 적합한 특성(높은 민감도와 결합 능력, 높은 BBB 통과 능력 및 체내 안전성 등)을 갖추고 있는 새로운 근적외선 형광 프로브가 지속적으로 개발 되었다. 또한, 바이오마커와 선택적으로 결합하여 광학 신호가 크게 증가하는 특성을 갖는 형광 프로브는 체내에서 선택성과 민감도가 높 은 영상을 제공할 수 있으므로 다른 분자 영상 기법에 비해 큰 장점을 가진다고 할 수 있다. 그러나 기존의 연구에서 보고된 대부분의 형광 프로브는 아밀로이드 베타 응집체(aggregates)와는 높은 결합력을 갖 고 있으나, 이보다 더 신경독성이 높은 것으로 알려져 있는 가용성 올 리고머 형태의 아밀로이드 베타에 대한 결합 능력은 낮은 것으로 알 려져 있다. 최근 아밀로이드 베타 올리고머와 잘 결합할 수 있는 프로 브로 CRANAD-102가 연구되었으나 여전히 만족할 만한 선택성은 보 이지 못한 것으로 알려져 있다. 향후 가용성 아밀로이드 베타 올리고 머를 선택적으로 검출할 수 있는 형광 프로브의 개발은 초기 단계의 알츠하이머병을 진단할 수 있는 분석 방법으로 개발될 것으로 기대된 다. 또한 타우 단백질 영상 연구도 타우 얽힘을 형성하기 전 단계의 중간체 혹은 전구체를 선택적으로 검출할 수 있는 프로브를 개발한다 면 알츠하이머병의 조기 진단에 큰 도움이 될 것이다. 결론적으로 근 적외선 형광 프로브는 전임상 단계에서 동물모델의 뇌 영상 연구에 매우 유용하게 활용될 수 있다. 이러한 연구를 통해 뇌에서 바이오마 커와 선택적인 결합이 검증된 형광 물질은 방사성 동위원소를 표지 과정을 통하여 새로운 진단용 방사성의약품의 개발로도 이어질 수 있 을 것으로 예상된다. 실제 PET, SPECT와 같은 핵의학 영상은 광학 영상 기법의 단점이 없으며 임상에도 적용될 수 있는 가능성이 있다. 향후 활발한 연구를 통하여 궁극적으로 알츠하이머병의 조기 진단과 치료에 활용될 수 있는 유용한 뇌 영상 프로브의 개발을 기대한다.

Acknowledgement

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (Grant number: 2019R1F1A1061596).

Figures

Figure 1.(a) Production of Aβ monomer by sequential enzymereactions. (b) Formation of Aβ plaque from Aβ monomer.

Figure 2.Formation of neurofibrillary tangles (NFTs).

Figure 3.Molecular structure of representative probes for diagnosis of Alzheimer’s disease.

Figure 4.Molecular structure of (a) NIAD-4, (b) NIAD-11, and (c) NIAD-16.

Figure 5.Molecular structure of (a) IR-780, (b) AN-SP, (c) MC-1, and (d) ZT-1.

Figure 6.Molecular structure of CyPDA2.

Figure 7.Molecular structure of (a) CRADAD-2, (b) CRANAD-58, (c) CRANAD-3, and (d) CRANAD-102.

Figure 8.Molecular structure of 1c, 3h, 2e, and 2c.

Figure 9.Molecular structure of (a) BAP-2, (b) BD-Oligo, and (c) QAD-1.

Figure 10.Molecular structures of Tau 1 and Tau 2.

Figure 11.Molecular structure of (a) SLOH, (b) DBA-SLOH, and (c) SLM.

Figure 12.Molecular structure of DANIRs.

Tables

Table 1.Summary of Physical Properties of Fluorescence Probes for Imaging AD Biomakers

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