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ISSN : 1225-0112(Print)
ISSN : 2288-4505(Online)
Applied Chemistry for Engineering Vol.31 No.6 pp.612-623
DOI : https://doi.org/10.14478/ace.2020.1070

Evaluation for Interactive Toxic Effects of Binary Heavy Metals on Bacterial Growth and Phosphorus Removal under Co-Culture Condition of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp.

Deok-Hyun Kim*, Sang-Wook Park, Deok-Won Kim, Ji-Su Park**, Eun-Ji Oh***, Jin Yoo, Keun-Yook Chung†
Department of Environmental and Biological Chemistry, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Republic of Korea
*National Institute of Environmental Research, Incheon, 22689, Republic of Korea
**EHS Part, Doosan Corporation Electro-Materials, Gimcheon 39541, Republic of Korea
***Water and Land Research Group/Division for Natural Environment, Korea Environment Institute, Sejong 30147, Republic of Korea
†Corresponding Author: Chungbuk National University, Department of Environmental and Biological Chemistry, Cheongju 28644, Republic of Korea Tel: +82-43-261-3383 e-mail: kychung@cbnu.ac.kr
September 1, 2020 ; October 8, 2020 ; October 15, 2020

Abstract


This study was initiated to quantitatively evaluate the inhibitory effects of five heavy metals (Cd, Cu, Zn, Pb, Ni) on bacterial growth and phosphorus removal in the binary culture of Alcaligenes sp. plus Pseudomonas sp. IC50 values of Alcaligenes sp. plus Pseudomonas sp. for Cd, Cu, Zn, Pb, and Ni were 0.75, 10.93, 7.08, 13.30, and 15.78 mg/L, respectively. For the binary treatments of heavy metals, IC50 was the lowest in the treatment of Cd + Cu, whereas, it was the highest in the Ni + Pb treatment. The EC50 values for Cd, Cu, Zn, Pb, and Ni were 0.54, 11.08, 6.14, 9.33, and 13.81 mg/L, respectively. For the binary treatments of heavy metals, EC50 was the lowest in the Cd + Zn, whereas, the highest in the Zn + Ni. Based on both IC50 and EC50 values for the binary culture of bacteria with the binary mixtures of heavy metals, the most interactive effect was found to be antagonistic, though the only synergistic effect was found in Cu + Ni treatment. Therefore, our results can provide basic data on the toxic effects of heavy metals on the bacterial growth and phosphorus removal in the wastewater treatment process.


Alcaligenes sp. , Pseudomonas sp. , Co-Culture , Heavy metals , Toxicity

Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp.의 공동배양 조건에서 박테리아 생장 및 인 제거에 미치는 두 종 중금속의 상호적인 독성효과 평가

김 덕현*, 박 상욱, 김 덕원, 박 지수**, 오 은지***, 유 진, 정 근욱†
충북대학교 환경생명화학과
*국립환경과학원 토양지하수연구과
**두산전자 EHS팀
***한국환경정책평가연구원 자연환경연구실

초록


본 연구는 Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp. 균주를 2종 혼합 배양 시, 혼합균주의 생장 및 인 제거에 5종의 중금속(Cd, Cu, Zn, Pb, Ni)이 미치는 저해효과를 정량적으로 평가하고자 수행되었다. 단일 중금속 처리 시 중금속별 Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp. 균주의 IC50는 Cd 0.75 mg/L, Cu 10.93 mg/L, Zn 7.08 mg/L, Pb 13.3 mg/L, Ni 15.78 mg/L 인 것으로 나타났다. 중금속 2종 처리 시 IC50는 Cd + Cu 처리구에서 가장 낮은 농도를 보였고, Ni + Pb 처리구에서 가장 높은 농도를 보였다. 단일 중금속 처리 시 중금속별 EC50 값은 Cd 0.54 mg/L, Cu 11.08 mg/L, Zn 6.14 mg/L, Pb 9.33 mg/L 및 Ni 13.81 mg/L이었다. 2종의 중금속 혼합 처리구별 EC50은 Cd + Zn 처리구에서 가장 낮은 농도, Zn + Ni 처리구에서 가장 높은 농도를 보였다. 2종 혼합 균주에 대한 2종 중금속 처리 결과 도출된 IC50 및 EC50 값을 기반 중금속 별 상호작용 평가 결과, 대부분 길항작용을 보이는 것으로 나타났으나, Cu + Ni 처리구에서는 상승작용을 보이 는 것이 확인되었다. 따라서 본 연구 결과는 미생물을 이용한 오폐수 정화 처리 시 미생물의 성장 및 인 제거에 미치 는 중금속의 독성으로 인한 저해효과에 대한 기초 자료를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.


    1. 서 론

    부영양화는 화학비료나 오수의 유입 등으로 물에 질소와 인과 같은 영양분이 과잉 공급되는 현상으로 하천 및 호소에 생활하수, 축산 및 산업 폐수, 화학비료 등 오염원이 유입되면서 발생한다. 이로 인해 수 중 조류 및 병원성 세균이 과도하게 번식하고, 악취가 나며, 수중 용 존산소 또한 고갈된다. 결과적으로 수생태계에 악영향을 주며 수질오 염을 발생시킨다[1]. 이러한 현상을 방지하기 위해서는 질소와 인이 수계로 유입되는 것을 막거나 유입되더라도 신속히 제거할 수 있어야 한다.

    인을 제거하는 공법은 크게 물리화학적 공법과 생물학적 공법의 2 종류로 분류할 수 있다[2,3]. 최근에는 인 제거 시 2차 오염을 거의 발 생시키지 않는 생물학적 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 생 물학적 인 제거 공정은 인염 축적균[4,5]에 혐기-호기조건을 교차시켜 luxury uptake를 유발하여 폐수 중 인을 제거하는 방법이다[6,7]. 현재, 인 제거를 위해 제시된 방법 중 가장 널리 인정받고 있는 모델은 Mino 모델[8,9]과 Comeau-Wentzel 모델[2,10]인 것으로 알려져 있다.

    기존의 생물학적 인 제거에 대한 연구는 기존 공정의 공정변수 변 화, 단일 미생물을 이용한 효율적인 인 제거가 가능한 새로운 공정의 개발 등을 통한 공정의 최적화에 대한 연구가 주를 이루고 있다 [11-14]. 그러나 단일 미생물을 이용한 인 제거 방법을 오염 현장에 적 용시킬 경우, 현장 내 오염물질은 인뿐만 아니라 대부분 유기물, 중금 속 등이 복합적으로 존재하기 때문에 기존의 인 제거 연구는 한계가 있다는 보고가 있다. 특히, 납, 구리, 아연, 니켈, 카드뮴 등의 중금속 은 인간을 비롯한 대다수 생물에 대한 위해성이 큰 물질로 이들의 사 용량은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다[15]. 현재, 세계 각국에서는 중 금속 제거 및 배출 관리에 대한 다양한 연구를 실시하고 있다[16,17]. 중금속 생태 독성에 대한 기존 연구들[18]은 대부분 단일 중금속 저해 를 정량 및 정성적으로 평가하는 방법이다. 이러한 연구는 미생물을 이용한 중금속 오염정화에 필요한 기초자료를 제공하는 것으로 제안 되고 있으나[19-21], 중금속으로 인한 환경오염은 여러 종류의 중금속 이 혼합되어 나타나는 경우가 대부분으로[22,23], 이에 대한 연구는 부 족한 실정이다. 이러한 점을 고려하여 최근에는 두 종류 이상의 중금 속이 혼재 시 발생되는 효과(antagonism/synergism)에 대한 연구가 수 행되고 있다[24,25]. 중금속 간 상호작용에 대한 연구는 대부분 혼합 중금속이 어패류[26-28] 또는 식물[29,30]에 작용하였을 때 미치는 영 향에 관한 내용으로, 미생물에 대한 연구는 부족한 실정이다. 그러므로 단일 및 혼합 중금속이 미생물에 미치는 영향에 대한 정량적 평가를 통한 중금속별 독성효과를 비교하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

    본 연구에서는 인을 축적하는 능력을 가지고 있는 미생물로 알려진 Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp.를 혼합 처리하여 실험을 실시하였 다. 이들은 비교적 최근에 인 제거능이 우수하다는 연구결과를 보였으 며[31-33], 다양한 환경에서 널리 존재하는 균종이므로 연구에 적합한 것으로 사료된다. 2종 혼합 처리 균주에 다양한 농도의 중금속을 2종 혼합 처리하였다. 실험을 통해 균주와 중금속을 2종 혼합 처리 시 균 주의 생장 및 인 제거에 중금속이 미치는 영향을 정량적으로 평가하 였다. 이를 통해 실제 현장에 균주의 적용 가능성 여부 및 다양한 상 호작용을 확인하고자 한다. 연구 결과는 기존의 공정 시스템에 관한 연구뿐 아니라 여러 미생물을 동시에 이용하였을 때 발생하는 여러 효과를 이용함으로써 좀 더 다각적인 측면에서 다양한 연구가 실시될 수 있을 것이라 사료된다.

    따라서 본 연구는 부영양화의 주요 제한 인자인 인을 축적하는 능 력을 가진 미생물(phosphate accumulating organisms, PAOs)로 알려진 Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp. 미생물을 공동배양하여 5종류의 중 금속들을 단일 및 이종 혼합 처리 시 혼합 미생물의 생장 및 인 제거 에 미치는 독성 효과를 평가하기 위해 수행되었다.

    2. 실 험

    2.1. 미생물 배양

    본 연구에 사용된 미생물은 Alcaligenes sp.(A), Pseudomonas sp.(P) 로, 각 균주를 2종 혼합 배양하였다. 미생물 배양에 사용된 배지는 Zafiri 배지를 변형하여 제조하였다. 연구에 사용된 배지는 기초배지용액, 미 량금속용액, 1 M tris 완충 용액, 포도당 용액, 인산 용액으로 구성되 어 있으며, 각 용액별 구성은 다음과 같다. 기초배지용액은 증류수 1 L 내에 NH4Cl 1.91 g, CaCl2⋅H2O 0.03 g, MgSO4⋅7H2O 0.2 g, 이스 트 추출물 0.02 g, 펩톤 0.2 g이 용해되어 있고, 미량 금속 용액은 증류 수 100 mL에 H3BO3 0.03 g, CuSO4⋅5H2O 0.1 g, ZnSO4⋅7H2O 0.2 g, MnSO4⋅H2O 0.2 g, NaMo4⋅2H2O 0.04 g이 용해되어 있다. 인산 용액은 초기농도가 1000 mg/L가 되도록 하였고, 포도당용액은 glucose의 초기농도가 100000 mg/L가 되도록 하였으며, 완충용액으로 1 M tris base 용액을 사용하여 배지의 pH를 7.0 ± 0.2 범위에 포함되도 록 조정하였다[34]. 처리구별 사용된 배지의 양은 50 mL이고, 혼합 균 주(Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp.)는 각각 0.5 mL 첨가하였다. 배 지 내 초기 인 농도는 20 mg/L 로 설정하였고, 30 ℃, 150 rpm 조건의 진탕 배양기에서 24 h 배양하였다. 균주의 활성화를 위하여 실험 시작 3 week 전부터 luria bertani (LB)배지와 실험배지를 이용하여 계대배 양을 실시하였다.

    2.2. 중금속 처리

    처리구의 설정은 실험 배지에 균주를 처리하지 않은 blank, 배지에 균주만 처리한 대조구, 단일 및 2종 중금속을 중금속 별 4개 농도로 처리한 중금속 처리구로 하였다. 중금속 간 상호작용을 평가하고자 우선 2종 혼합 균주에 단일 중금속을 처리하여 실험을 실시하였다. 이 후 2가지 중금속을 혼합 처리하여 중금속 간 상호작용을 평가하였다. 실험에 사용된 중금속은 납, 구리, 아연, 니켈, 카드뮴으로, 모든 표준 용액은 Kanto 사에서 시판되는 제품을 사용하여 제조하였다. 단일 중 금속 처리 시 배지 내 중금속별 처리 농도는 다음과 같다. 중금속별 처리 농도는 납 0, 4, 8, 12, 20 mg/L, 카드뮴 0, 0.2, 0.4, 0.6, 1 mg/L, 아연 0, 3, 6, 9, 15 mg/L, 니켈 0, 6, 12, 18, 30 mg/L, 구리 0, 4, 8, 12, 20 mg/L이었다(Table 1). 2종 중금속 혼합 처리 시 배지 내 중금속 농도는 혼합 전 각 중금속별 처리 농도를 합한 것과 동일한 농도가 되도록 하였다. 예를 들어 납과 카드뮴을 혼합 처리 시 처리구별 농도 는 0 (0 + 0), 4.2 (4 + 0.2), 8.4 (8 + 0.4), 12.6 (12 + 0.6), 21 (20 + 1) mg/L이다(Table 2).

    2.3. 생육도 측정 및 인산 정량

    균의 생육도는 배지의 optical density (OD) 분석을 통해 측정하였 다. OD 측정을 위한 배양액은 멸균 syringe로 채취하였다. 채취한 시 료는 분광광도계(UV Mini 1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 600 nm의 파장에서 3 h마다 1회 흡광도를 측정하였다. 배지 내 총 인 농 도는 ascorbic acid에 의한 몰리브덴 청법을 변형하여 측정하였다[31]. 생육도 측정과 동일한 분광광도계를 이용하여 880 nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였으며, 초기 및 최종 인 농도의 비교를 통해 혼합 미 생물 처리구 간 인 제거 효율을 비교 분석하였다.

    2.4. IC50 및 EC50 추정

    반수 생장 저해 농도(IC50; half of inhibition concentration of bacterial growth) 및 반수 인 제거 효율 저해 농도(EC50; half of effective concentration of phosphorus removal efficiencies)의 계산은 흡광도 값 에 자연로그를 취한 값을 시간별로 최소 제곱 추정에 의해 나타나는 선형 회귀식을 이용하였다. 반수치사농도인 IC50를 추정하기 위한 log gamma 분포는 생장 저해 결과를 회귀 분석하여 결정하였고[35], EC50 은 중금속 처리에 따른 인 제거가 대조구의 절반이 되는 지점으로 추 정하였다[36].

    2.5. 중금속 간 상호작용 평가

    중금속 혼합 처리 시, 중금속 간 상호작용을 확인하기 위해 additive toxicity index method를 이용하였다. Additive toxicity index method는 각각의 화학물질의 IC50 및 EC50 값과 혼합되었을 때의 IC50 및 EC50 값을 구해 이를 이용하여 혼합물질의 독성에 대한 각각 화학물질의 기여도를 평가하는 방법으로 계산식은 식 (1)과 같다.

    S = A m A i + B m B i
    (1)

    • S: 독성 반응의 총 합

    • Am: 혼합 시 나타나는 A 물질의 IC50

    • Bm: 혼합 시 나타나는 B 물질의 IC50

    • Ai : 단일로 존재할 때 나타나는 A 물질의 IC50

    • Bi : 단일로 존재할 시 나타나는 B 물질의 IC50

    위의 식에서 계산한 S 값을 이용하여 2종의 중금속 간 상관관계를 AI (additive index value)값을 기준으로 하여 평가할 수 있다. S 값이 1보다 작을 경우, AI 계산은 1/S - 1.0으로, S 값이 1보다 큰 경우, -S + 1.0, S 값이 1일 경우 S - 1 (= 0)으로 계산한다. AI 값 계산결과가 0보다 크면 중금속간 상승적 상호작용(synergistic interaction), 0보다 작으면 길항적 상호작용(antagonistic interaction) 으로, AI 값이 0일 경 우 상가적 상호작용(additive interaction)으로 판단할 수 있다[37].

    2.6. 통계분석

    실험 결과의 통계분석은 SAS software package version 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)를 이용하여 실시하였다. 실험결 과의 유의한 차이를 조사하기 위해 ANOVA (analysis of variance) 분 석과 Tukey’s HSD (honest significant difference) test를 실시하였으며, 신뢰 구간은 95% 수준으로 설정하였다. 모든 실험은 세 번 반복하여 실시되었다.

    3. 결 과

    3.1. Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp. 공동배양 시 생장에 대한 중금속 저해 효과

    3.1.1. 단일 중금속 처리

    Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp. 균주 혼합배양에 중금속 별 생장 저해 효과를 비교하고자 실험을 실시하였다. 혼합균주가 포함된 배지 에 처리한 중금속의 농도에 따른 균주의 생장 및 IC50를 측정하였다. 생장의 경우, 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 미생물의 OD600 값 이 감소하는 경향이 확인되었다(Figure 1).

    또한, 균주의 생장곡선을 기초로 하여 미생물의 비 생장 속도(SGR; specific growth rate)를 도출하였다. SGR 도출을 위해 OD600 흡광도 값에 자연로그를 취하고, x축을 시간으로, y축을 ln(G2/G1)로 하는 그 래프를 작성하였다. SGR은 각 미생물의 OD600 값이 가장 활발하게 증 가하는 구간인 log phase를 기준으로 측정하였으며, 이 값은 앞에서 작성한 그래프의 기울기와 동일하다. SGR을 이용하여 중금속 처리에 따른 균주에 대한 growth inhibition (GI, %)을 inhibition (%) = (μcontrol - μheavy metal) × 100/μcontrol의 식으로 계산하였으며, data를 fitting 하여 중금속 처리 시 균주의 생장이 절반이 되는 농도인 IC50 (mg/L)을 추 정하였다(Figure 2).

    중금속 별 GI 분석 결과, 카드뮴 처리구의 GI (%)는 각각 4.3, 23.7, 42.2, 61.6%이었다. 구리 처리구 별 GI (%)는 10.5, 14.6, 71.4, 93.8% 이었으며, 아연의 경우, GI (%)는 8.1, 42.9, 56.1, 97.7%로 나타났다. 납 처리구에서 GI (%)는 16.7, 28.9, 49.0, 73.1%이었으며, 니켈 처리 구 별 GI (%)는 16.0, 33.0, 48.6, 93.1%이었다. 모든 중금속이 공통적 으로 처리농도의 증가에 따라 혼합균주의 생장에 미치는 저해효과가 증가하였다. IC50 농도 추정결과는 Table 3과 같다. IC50 농도를 기준 으로 저해효과를 비교한 결과, Cd > Zn > Cu > Pb > Ni의 순으로 생장에 미치는 저해효과가 강한 것이 확인되었다.

    3.1.2. 2종 혼합 중금속 처리

    2종류의 중금속을 처리하였을 때의 저해효과의 확인을 위해 혼합 균주가 포함된 배지에 처리한 중금속과 그 농도에 따른 균주의 생장 과 IC50를 측정하였다. 중금속 동시 처리에 따른 상호작용의 판단은 additive index value를 이용하였다. 2종의 중금속 처리 시 공통적으로 처리농도가 증가할수록 미생물의 생장은 감소하는 경향을 보였다 (Figure 3-1, 3-2). 또한, 미생물의 활성이 급격히 증가하기 시작하는 phase인 log phase에 도달하는 시간이 지연되는 것을 확인할 수 있었 다. 혼합 중금속 처리구별 혼합 균주에 대한 생장 저해정도(GI, %)를 계산 후, data를 fitting하여 2종 중금속 처리 시 중금속 별 IC50 농도를 추정하였다(Figure 4- 1, 4-2). 중금속 간 상호작용 평가 결과는 Table 4와 같다. 균주의 생장에 미치는 저해효과는 Cd + Cu ≥ Cd + Zn > Cd + Ni > Zn + Pb ≥ Cu + Zn ≥ Cd + Pb > Cu + Pb > Cu + Ni ≥ Zn + Ni ≥ Pb + Ni의 순으로 나타났다. 중금속 혼합 처리에 따른 상호작용 평가 결과, 전체적으로 길항 효과를 보이는 것을 확인 할 수 있었다.

    3.2. Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp.의 공동배양 시 인 제거능 에 미치는 중금속 저해효과

    3.2.1. 단일 중금속 처리

    단일 중금속 처리 시 혼합 균주의 인 제거효율에 미치는 저해효과 를 확인하고자 실험을 실시하였다. 혼합균주가 포함된 배지에 처리한 중금속 처리구별 인 제거율과 EC50을 측정하였다. 중금속 처리구 별 인 제거율은 Figure 5와 같으며, 중금속의 종류에 관계없이 처리 농도 가 증가할수록 인 제거 효율이 감소하는 경향을 보였다. 인 제거효율 은 대조구에서 가장 높았으며, 처리구별 인 제거 효율을 이용하여 중 금속 처리농도에 따른 인 제거 저해효과를 평가하였다. 평가 결과, 카 드뮴 처리구의 인 제거효율은 대조구에 비해 각각 15.0, 36.0, 49.7, 85.0% 감소한 것으로 나타났다. 구리의 경우, 대조구에 비해 인 제거 효율이 각각 10.5, 25.1, 52.7, 90.5% 감소하였고, 아연은 각각 14.2, 50.1, 70.3, 91.3% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 납 처리구는 대조구 에 비해 인 제거효율이 각각 26.7, 47.3, 54.0, 75.4% 감소하였고, 니켈 처리구는 각각 22.9, 37.1, 72.8, 91.6% 감소한 것으로 나타났다. 중금 속 처리에 따른 인 제거 저해효과를 기초로 하여 혼합 균주의 인 제거 반응이 절반이 되는 농도인 EC50을 추정하였으며, 그 결과는 Table 5 와 같다. 중금속 중 인 제거에 대한 저해효과가 가장 큰 항목은 카드 뮴으로 EC50은 0.54 mg/L이었다. 상대적으로 인 제거 저해효과가 약 한 중금속은 니켈로, EC50은 13.81 mg/L이었다. EC50을 기초로 중금속 처리에 따른 인 제거 저해효과를 비교한 결과, Cd > Zn > Pb > Cu > Pb 순으로 강한 것을 확인할 수 있었다.

    3.2.2. 2종 혼합 중금속 처리

    중금속 혼합 처리 시 혼합 균주의 인 제거에 미치는 영향을 정량적 으로 평가하고자 초기 인 농도와 최종 인 농도를 측정하였으며, 각 처 리구 별 인 제거율은 Figure 6-1, 6-2와 같다. 인 제거효율은 처리한 중금속의 농도가 증가할수록 감소하는 경향을 보였고, 인 제거효율은 중금속을 처리하지 않은 대조구에서 가장 높은 것으로 나타났다. 대 조구를 포함한 모든 처리구의 초기 및 최종 인 농도를 측정하여 인 제거율을 계산하였고, 대조구의 인 제거율은 87.3% 로 나타났다. 중 금속 처리 농도가 증가할수록 인 제거율은 감소하는 경향을 보였으며, 각 중금속 처리구별 인 제거율은 다음과 같다. Cd + Cu 처리구는 59.3, 41.6, 31.5, 7.9%, Cd + Zn 처리구는 66.4, 43.8, 28.6, 8.8%, Cd + Pb 처리구는 67.1, 58.6, 28.1, 8.2%, Cd + Ni 처리구는 57.4, 39.1, 23.3, 7.6%, Cu + Zn 처리구는 65.6, 46.8, 31.6, 7.5%, Cu + Pb 처리구 는 65.9, 52.8, 25.1, 14.7%, Cu + Ni 처리구는 71.4, 46.8, 30.4, 12.7%, Zn + Pb 처리구는 68.2, 45.3, 24.8, 14.5%, Zn + Ni 처리구는 72.3, 56.7, 38.7, 18.5%, Pb + Ni 처리구는 67.5, 56.7, 35.4, 19.6%의 인 제 거 효율을 보였다. 그 후 인 제거율이 감소되는 정도를 계산하여 인 제거반응 저해정도를 측정하였고, data를 fitting하여 인 제거반응이 절 반이 되는 지점인 EC50을 추정하였다. 중금속 혼합 시, 상호작용의 판 단은 additive index value를 이용하였다(Table 6). EC50에 해당하는 농 도는 Zn + Ni ≥ Pb + Ni > Cu + Ni > Cu + Pb > Zn + Pb ≥ Cu + Zn > Cd + Pb ≥ Cd + Ni > Cd + Cu ≥ Cd + Zn의 순으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 즉, Alcaligenes sp.와 Pseudomonas sp.로 구성 된 혼합균주는 Cd + Zn, Cd + Cu 중금속이 혼합된 환경에서의 적응 성이 떨어지고, Pb + Ni, Zn + Ni 중금속이 혼합된 환경에서의 적응력 이 상대적으로 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 중금속 간 상호작용 평 가 결과, Cu + Ni 처리구에서 중금속 간 synergistic effect가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.

    4. 고 찰

    EC50은 IC50에 비해 낮은 수치를 보였고, IC50의 경우와 유사한 경향 을 보이는 것으로 나타났으며, EC50와 IC50 간 상관관계가 존재할 것 이라 사료된다. 혼합 처리 균주는 5종의 중금속 중 카드뮴에 대한 내 성이 상대적으로 약하고, 니켈에 대한 내성이 상대적으로 강한 것을 확 인할 수 있었다. 중금속 혼합 시, IC50을 기초로 한 생장 저해 평가 결 과, Cd + Cu 처리구에서 생장 저해가 가장 강하고(IC50 = 6.35 mg/L), Pb + Ni 처리구에서 상대적으로 약한 것(IC50 = 6.35 mg/L)이 확인되 었다. 인 제거효율을 기초로 하여 추정한 EC50은 혼합배양균주에 대 해 Cd + Zn 처리구에서 6.66 mg/L로 가장 낮았고, Zn + Ni 처리구에 서 24.53 mg/L로 가장 높았다. 중금속 간 상호작용 평가 결과, 전체적 으로 길항 효과를 보이는 것으로 확인되었다[38]. 이는 중금속 간 혼 합 처리 시 독성은 대부분 첨가효과(additive interaction) 또는 상승효 과를 보이는 것으로 보고하였던 [39]과 [40]의 연구보고와 상이하였 다. 그러나 [13]은 독성의 연구에 활용한 bioassay의 method에 따라 혼 합 독성의 양상이 다르게 나타날 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 대부분의 처리구에서 길항효과를 나타낸 것은 생물학적 독성평가에 서 일반적으로 사용하는 미생물(E. Coli, Vibrio fischeri 등)이 아닌 인 축적능을 갖는 미생물을 선별하였기 때문이라 사료된다. Cd가 포함된 혼합 중금속 처리구는 전체적으로 길항효과를 보이는 것이 확인되었 다. 이러한 연구 결과는 생물학적 독성 검사 시, Cd가 다른 물질과 혼 합 시 세포에 미치는 독성이 감소한다는 연구결과에 부합한다[41,42]. 또한, [43]은 toxic unit (TU)를 이용하여 Cd와 Zn 간 joint effect에 대 한 연구 결과, 길항 효과를 보인다고 보고하였으며, [22]는 오이의 생장 에 Cd와 Cu 간 길항 효과를 확인하였다고 보고하였다. Cu의 경우, Zn 과 혼합 시 상승 효과를 보인다고 알려져 있으며[44,45], [30]는 Tympanotonus fuscatus var radula(L.)에 Cu와 Zn 혼합 처리 시 상승효과 를 보인다고 보고하였다. 반면, [23]은 Cu와 Pb와 혼합 시 길항 효과 를 보인다고 보고하였다. 연구 결과는 단일 및 2종 혼합 중금속이 인 제거 미생물의 생장 및 기능에 미치는 독성효과에 대한 기초자료를 제공하며, 다양한 종류의 인 축적 미생물에 중금속이 미치는 독성평 가에 관한 연구에 기초자료로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.

    5. 결 론

    본 연구는 인 축적 미생물을 2종 혼합 배양 시 중금속을 단일 및 2종 혼합 처리할 경우 중금속이 인 축적 미생물의 생장 및 인 제거에 미치는 영향을 정량적으로 평가하는 것을 목적으로 실시되었다. 연구 결과, 다음과 같은 결론을 도출할 수 있었다.

    • 1. 모든 중금속 처리구에서 공통적으로 중금속 처리 농도가 증가함 에 따라 2종 혼합 균주의 생장 및 인 제거에 미치는 저해 효과가 증가 하는 경향이 확인되었다.

    • 2. 5종의 중금속을 단일 처리 시, 중금속별 생장 및 인 제거에 미치 는 저해 효과는 Cd가 가장 강하고, Ni 가 가장 약한 것으로 나타났다.

    • 3. 5종의 중금속을 2종 혼합 처리 시, 2종 혼합 균주의 생장에 미치 는 저해 효과는 Cd + Cu 처리구가 상대적으로 강하고, Pb + Ni 처리 구가 상대적으로 약한 것으로 나타났고, 인 제거에 미치는 저해효과 는 Cd + Zn 처리구가 상대적으로 강하고, Zn + Ni 처리구가 상대적으 로 약한 것을 확인할 수 있었다.

    • 4. 중금속 2종 혼합 시 중금속 간 상호작용 평가 결과, 대체적으로 길항 효과를 보였으나, 인 제거에 대해서 Cu + Ni 처리구에서 상승효 과를 보였다.

    본 연구 수행과정에서 도출한 결과는 단일 및 이종 중금속이 인 제 거 미생물의 생장 및 기능에 미치는 독성 효과에 대한 기초자료를 제 공함으로써 중금속 독성 평가에 관한 연구에 활용될 수 있을 것이라 사료된다.

    감 사

    본 연구는 한국연구재단의 이공분야기초연구사업 연구비지원(과제 번호 2019R1F1A1063252)에 의해 수행되었습니다.

    Figures

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    Growth of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing single heavy metal; (A) Pb, (B) Cd, (C) Zn, (D) Ni and (E) Cu. Error bar means standard deviation.
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    Growth inhibition of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing single heavy metals; (A) Pb, (B) Cd, (C) Zn, (D) Ni, (E) Pb. Error bar means standard deviation (n = 3).
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    Growth of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing binary heavy metals; (A) Pb + Ni, (B) Zn + Ni, (C) Zn + Pb, (D) Cu+Ni, (E) Cu + Pb. Error bar means standard deviation (n = 3).
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    Growth of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing binary heavy metals; (A) Cu + Zn, (B) Cd + Ni, (C) Cd + Pb, (D) Cd + Zn, (E) Cd + Cu. Error bar means standard deviation (n = 3).
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    Growth inhibition of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing binary heavy metals; (A) Pb + Ni, (B) Zn + Ni, (C) Zn + Pb, (D) Cu+Ni, (E) Cu + Pb.
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    Growth inhibition of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in medium containing binary heavy metals; (A) Cu + Zn, (B) Cd + Ni, (C) Cd + Pb, (D) Cd + Zn, (E) Cd + Cu.
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    Removal efficiencies of P by Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in relation to single heavy metal treatments. Error bar means standard deviation (n = 3); (A) Cd, (B) Cu (C) Zn, (D) Pb, (E) Ni. * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at ⍺ = 0.05 level.
    ACE-31-6-612_F6-1.gif
    Removal efficiencies of P by Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in relation to binary heavy metal treatments. Error bar means means standard deviation (n = 3); (A) Cu + Pb, (B) Cu + Ni (C) Zn + Pb, (D) Zn + Ni, (E) Pb + Ni. * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at ⍺ = 0.05 level.
    ACE-31-6-612_F6-2.gif
    Removal efficiencies of P by Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. in relation to binary heavy metal treatments. Error bar means means standard deviation (n = 3); (A) Cd + Cu, (B) Cd + Zn (C) Cd + Pb, (D) Cd + Ni, (E) Cd + Zn. * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at ⍺ = 0.05 level.

    Tables

    Concentration of Single Heavy Metals Treated
    Concentrations of Binary Heavy Metals Treated
    IC50 of Alcaligenes sp. and Pseudomoas sp. with Single Heavy Metal Treated
    * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at ⍺ = 0.05 level.
    IC50 and Interaction of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. with Binary Heavy Metals Treatments
    * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at α = 0.05 level.
    EC50 of Alcaligenes sp. and Pseudomoas sp. with Single Heavy Metals Treatments
    * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at α = 0.05 level.
    EC50 and Interaction of Alcaligenes sp. and Pseudomonas sp. with Binary Heavy Metals Treatments
    * Means followed by different letters indicate that they are significantly different from each other based on the ANOVA at α = 0.05 level.

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