1. 서 론

벼(Oryza sativa L.)는 벼과(Gramineae)에 속하는 1년생 초본식물로 아시아 전역에 널리 분포하고 있으며, 높이는 50~100 cm이며 뿌리에 가까운 곳에서 가지를 쳐서 포기를 형성하여 자란다[1]. 특히, 아시아 지역에서는 하루 열량의 절반 이상을 섭취하고 있는 중요한 곡류이며, 우리나라 충북 청원군 소로리에서 발굴된 볍씨는 1만 5천 년 전의 것 으로 확인되어 그동안 전 세계에서 발견된 가장 오래된 쌀로 인정받 을 정도로 한반도에서 쌀을 먹은 역사는 매우 오래되었다.

벼 육종의 주요 목표는 수량 증대, 품질 향상, 재배안정성 확대로 사회 요구와 시대 흐름에 따라 육종의 우선순위가 변화한다. 1950~ 1960년대는 ‘팔달’ 등 국내에서 개발된 근대 자포니카 품종이 주로 재 배된 기간이며, 이후 수량 증대가 최우선 육종목표 로 설정됨에 따라 1970년대 자포니카와 인디카 생태형간 원연교잡을 통해 다수성 통일 형 벼 품종 개발에 성공하여 쌀 자급을 이룩하였다. 쌀 자급을 이룬 1980~1990년대는 밥맛 좋은 쌀에 대한 소비자의 요구가 증가함에 따 라 수량 증대에서 품질 향상으로 육종목표가 전환되기 시작하는 과도 기로 양질 다수성 및 내병충성을 육종목표로 한 자포니카 품종이 개 발되기 시작하였고, 2000년대 이후에는 WTO, FTA 등 쌀 시장 개방 에 대응하고 국민에게 밥맛 좋은 쌀을 제공하기 위한 품질 향상에 중 점을 둔 육종사업이 수행되고 있다[2].

쌀은 밥 짓는 용으로 쓰이는 백미나 현미, 기름(현미유) 외에도 고 급 기능성 식품의 소재가 되는 쌀 단백질, 기능성 당, 식이섬유를 비 롯해 친환경 사료(쌀겨)로도 쓰일 수 있는 활용 잠재력이 큰 고부가가 치 곡물자원이다. 이중 많은 연구가 진행되고 있는 미강을 이용한 단 백질은 식품 산업에서 큰 관심을 차지하고 있다. 식품산업에서 미강 단백질은 저알레르기성이라는 특징으로 인해 다른 단백질에 비해 대 체불가한 장점이며[3], 아토피⋅천식 등 면역질환이 있는 환자나 어린 이⋅노인 등 면역력이 약한 취약 계층에게도 도움이 될 수 있다고 알 려져 있다. 최근에는 벼와 쌀의 생리활성을 중심으로 식의약, 화장품 소재로서의 연구가 진행되었다[4,5].

특히 미강유는 페룰산(ferulic acid), 감마-오리자놀(gamma-oryzanol), 피틱산(phytic Acid) 등을 함유하고 있어 항산화 효과가 우수하며[6,7], 피부 질환 치료를 위한 방사선 조사로부터 손상된 피부를 보호하기 위해 사용하는 나노 캡슐 제형의 첨가제로 활용하고 있으며[8-11], 노 화방지, 탈모증 치료 등의 효과도 보고되었다[12-14].

그러나 식품으로서의 우수한 기능적 효과에도 불구하고 화장품 산 업에서는 그 활용 빈도가 매우 적다. 이는 기존의 미강으로부터 얻어 진 단백질 소재는 일반적으로 액상제품인 화장품 적용 시 변색, 변취 문제를 야기하며, 미강으로부터 단백질 성분을 분리하기 위해서는 화 장품 연구개발자 뿐만 아니라 소비자들이 기피하고 있는 유기용매를 활용하여 미강에 함유되어 있는 오일성분을 제거하기 위한 공정을 반 드시 거쳐야 한다. 또한 정제 과정 중에 감마-오리자놀(gamma-oryzanol), 옥타코사놀(octacosanol), 세라마이드(ceramide) 등 다양한 유효성분들 이 제거되어 화장품 원료로써의 기능 상실을 가져올 수 있다.

일반적으로 알려진 쌀로부터 단백질 성분을 분리하는 방법은 화학 적 추출방법으로 다량의 수산화나트륨(sodium hydroxide)을 사용하는 것이다. 즉 쌀 단백질과 전분의 혼합물을 알칼리 용액에 수 시간 동안 침지함으로써 이들을 분리시키는 방법인데, 이 방법의 경우 최종적으 로 상당히 많은 양의 염류(salts) 및 유해 가능성 폐기물을 생산해 낸 다. 다른 방법으로는 쌀을 분쇄하여 당분해효소를 사용하여 전분질을 제거한 후 단백질을 정제하는 방법이 있으나 공정에 사용되는 원료와 효소에 따라 최종 생산물의 성질이 매우 큰 차이를 나타낸다[15-17].

본 연구에서는 충북 청주지역(청원구 북이면) 생산 쌀(큰눈현미, 녹 찰현미, 향찰현미, 흑미, 홍현미, 홍찰현미)을 당분해효소 및 단백질분 해효소를 이용하여 쌀단백질 추출물을 제조하고, 항산화 및 수분 보 유력을 평가하여 화장품 소재로서의 가능성을 평가하였다.

2. 실 험

2.1. 실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 시료는 2018년에 청주시 청원구 북이면에 위치한 참라이스무지개쌀 영농조합법인에서 재배하고 수확된 큰눈현미(Bigeye brown rice), 녹찰현미(Green-kerneled brown rice), 향찰현미(Flavored brown rice), 흑미(Black rice), 홍현미(Red brown rice), 홍찰현 미(Red-kerneled brown rice)를 사용하였다. 또한 항산화 활성 및 수분 보유력 평가에 사용된 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate), ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), potassium persulfate 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였 다. 그 밖에 사용된 추출용매 및 모든 시약은 특급 시약을 사용하였다.

2.2. 효소 분해

쌀단백질 추출 시 사용되는 일반적인 방법이 효소추출공정이다. 먼 저 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 자일란 등의 섬유질을 분해할 수 있 는 효소를 처리하여 세포벽을 분해시킨다. 알파-아밀라아제, 헤미셀룰 라아제, 셀룰라아제는 약 10~27%의 단백질 용액을 만들 수 있다. 단 백분해효소인 프로테아제를 사용하여 추출하는 경우도 있는데, 이때 는 처리한 프로테아제가 세포벽을 용해하여 내부에 있는 단백질과 인 지질 등이 외부로 용출된다. 본 연구에서는 효소 분해 조건 설정을 위 하여 기능성 특수미 중 일반 쌀에 비해 3배 정도 큰 거대배아미인 큰 눈현미를 이용하여 단백질 분해 효소 및 당 분해 효소 선정 실험을 진행하였다.

2.2.1. 쌀단백질 추출물 제조를 위한 단백질 분해 효소 선정

상업적 생산이 가능한 식품용 효소 중에서 펩타이드 결합을 endo type으로 가수분해하여 적절한 크기의 고분자 단백질을 생성하는 알칼 라제(alcalase), 브로멜라인(bromelain), 파파인(papain) 등 3종의 효소 를 선정하여 쌀 사용량의 0.5% 농도로 실험에 사용하였다.

실험에 사용된 쌀은 효소반응이 원활히 진행되도록 분쇄하여 60 mesh 표준채(채눈크기 250 um)를 통과시켜 사용하였고, 사용량의 10 배 비율로 가수하여 실험을 진행하였다. 각 효소의 최적 조건과 단백 질의 변성방지와 미생물 번식 억제를 고려하여 45 ℃, pH 7에서 일정 시간 동안 가수분해를 진행하였다.

2.2.2. 당 분해 효소 전처리를 이용한 단백질 분해 수율

쌀의 화학적 성분은 품종, 생산지의 기후나 토질, 재배방법 등에 따 라 조금씩 차이는 있으나 현미와 백미의 성분은 대체로 탄수화물이 70~80%, 단백질 7~8%, 지방이 1~2% 정도로 알려져 있다. 멥쌀에는 약 20%의 아밀로스(amylose)와 약 80%의 아밀로펙틴(amylopectin)을 함 유하며, 찹쌀은 대부분이 아밀로펙틴이고 아밀로스는 거의 함유되어 있지 않다[18-20]. 고분자 탄수화물을 제거하기 위하여 전분의 α-1,4 결합배위를 가수분해하는 아밀라이제(amylase, Novozymes, Denmark) 와 전분의 환원 말단부터 α-1,4결합과 α-1,6결합에 모두 작용하여 전분을 거의 포도당으로 분해하는 누룩 정제 효소(nuruk, SK-Bioland, Korea)를 사용하였다.

실험은 초기 효소 선정을 위하여 쌀 사용량의 양의 0.5와 1% 농도 로 당분해효소를 첨가하여 5 h 반응을 진행시키고 85~95 ℃에서 30 min간 처리하여 효소를 실활시켰다. 반응액을 45 ℃로 냉각시키고 0.1 N 수산화나트륨수용액으로 pH 7로 조절한 후 알칼라아제(alcalase)로 5 h 효소 반응을 진행시켰다. 반응 종료 후 단백질 분석법을 이용하여 단백질 함량을 분석하였다.

2.2.3. 가수 비율에 따른 단백질 함량 분석

효소반응 시 쌀과 정제수 사용량의 적절한 비율을 설정하기 위하여 5~40배의 비율로 하여, 실험 2.2.2와 같은 조건으로 실험을 진행하였 다. 실험에 따른 결과는 얻어진 고형물량과 단백질량을 사용한 원료 대비 수율로 분석하였다.

2.3. 쌀단백질 추출물 제조

실험은 품종별로 쌀을 분쇄하여 60 mesh 표준채(채눈크기 250 um) 를 통과시킨 후 사용량의 1.0% 농도로 당 분해 효소를 첨가하여 5 h 동안 1차 효소 반응을 진행시키고 85~95 ℃에서 30 min간 처리하여 효소를 실활시켰다. 반응액을 45 ℃로 냉각시키고 0.1 N 수산화나트 륨수용액을 이용하여 pH를 7.0로 조절한 후 알칼라제로 5 h 동안 2차 효소 반응을 진행하였다. 반응 후, 반응 종료액에 에탄올 일정량을 첨 가한 후 48 h 침지시키고 필터(0.45 um)를 이용하여 여과하였다. 얻어 진 조추출물을 65 ℃에서 감압 농축하여 청원지역에서 생산되는 기능 성 특수미 6종에 대한 각각의 추출물(고형분 4%)을 제조하였다.

2.4. 쌀단백질 추출물의 단백질 함량 분석

단백질 농도 분석은 TaKaRa BCA Protein Assay Kit (TAKARA, Japan)를 이용하여 분석하였다. 이 방법은 단백질이 Cu 이온(Cu²⁺, Cu¹⁺)을 환원할 수 있는 성질을 이용한 방법으로, 단백질에 의해 환원 된 Cu 이온은 BCA (bioconcinic acid) 용액과 반응하여 보라빛의 화합 물을 생성하며, 이 화합물은 빛의 특정 영역(562 nm)에서 흡광도를 분석하는 방법이다.

2.5. DPPH법을 이용한 free radical 소거 활성 측정

DPPH radical 소거능은 Shimada K의 방법을 변형하여 측정하였다 [21]. 3.94 mg의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate, M.W. 394.32 g)를 100% 메탄올 100 mL에 녹여 만든 DPPH 용액(약 0.1 mM) 0.45 mL와 반응액 내에서 일정 농도가 되게 희석한 각각의 시료를 0.55 mL에 혼합하여 실험을 하였다. 실험은 37 ℃에서 10 min간 방치 시킨 후 UV/visible spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도 측정을 이용하여 항산화 효과를 분석하였다. 대조군은 시료 대신 용매를 가 하여 동일한 방법으로 측정하였으며 시료 자체의 색에 대한 흡광도 값을 보정해주기 위해 0.1 mM DPPH 대신 메탄올을 넣어 같은 방법 으로 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거능은 다음과 같이 계산 하였다.

2.6. ABTS radical 소거 활성 측정

ABTS radical 소거 활성 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의 해 생성되는 ABTS free radical이 시료 내의 항산화 물질에 의해 제거 되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다[22]. 7.4 mM 2,2-azino- bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)와 2.6 mM potassium persulfate를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24 h 동안 방 치하여 ABTS⁺을 형성시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.75 (± 0.1)가 되도록 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS radical 용액 900 μL에 농 도별 시료 100 μL를 가하여 혼합 후 흡광도의 변화를 위해 10분 후에 측정하였다.

2.7. 수분보유력 평가

품종별 쌀단백질 추출물의 보습력을 확인하기 위하여 Wang 등이 실험한 방법을 응용하여 수분 보유력을 평가하였다[23]. 제조된 품종 별 쌀단백질 추출물 2 g을 12 cm²의 용기에 각각 2 mL씩 적정한 후, 완전 건조된 CaCl₂를 흡습제로 사용하여 30 ℃ 온도로 유지한 데시게 이터 내에서 24 h 동안 방치하며 각 시료의 무게를 6회 측정하였다. 대조군은 동일한 용매(30% 1,3-부틸렌글라이콜)에 저분자 히알루론산 나트륨 4%를 녹여 제조한 용액을 사용하였고, 무처리 시험군은 용해 에 사용한 용매(30% 1,3-부틸렌글라이콜)를 사용하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 단백질 분해 효소 및 당 분해 효소 처리 쌀추출물의 단백질 함 량 분석

효소 분해 조건 설정을 위해 큰눈현미와 3종의 단백질 분해 효소를 사용하여 25 h 효소 반응을 진행한 결과를 Figure 1에 나타내었다. 각 추출물의 단백질 함량은 alcalase, bromelain, papain 순으로 높았으며, 특히 alcalase을 이용한 추출물의 단백질 함량은 4380 μg/mL로 무처리 군의 단백질 함량 1720 μg/mL보다 2.54배 높았다. 각각의 반응액은 7~8 h이 지나며 추출액에서 역한 취가 발생하였고, 이후 실험은 변취 문제 를 고려하여 단백질 효소 처리 시간을 5 h으로 설정하여 진행하였다.

Figure 2는 당 분해 효소를 이용한 전처리 실험 결과이며, 누룩정제 효소 1.0%를 사용한 경우가 단백질 함량이 가장 높은 것으로 나타났 다. 사용한 원료 대비 추출된 단백질량으로 환산하면 약 68.5 mg/mL 로 일반적으로 알려진 쌀의 단백질 함량인 7~8%가 대부분 추출됨을 확인 할 수 있었다. 정제수 사용량 설정을 위한 가수 비율에 따른 추 출물의 고형분 및 단백질 수율을 Figure 3에 나타내었다. 원료 대비 정제수 사용 비율이 10 : 1일 경우 고형분 및 단백질의 수율은 각각 83.0, 6.8%로 확인되었다. 가수 비율이 10배 이상인 경우에도 수율은 서서히 증가하였으나, 산업적 측면을 고려하여 가수비율은 10 : 1로 결정하였다.

3.2. 품종별 쌀단백질 추출물의 단백질 함량 분석

BCA Protein Assay Kit를 이용하여 품종별 쌀단백질 추출물의 단백 질 함량을 측정한 결과를 Figure 4에 나타내었다. 단백질 결합은 아미 노산 2개가 만나 카르복시기(-COOH)와 아미노기(-NH₂)가 결합하고 H₂O가 빠져나오는 탈수축합반응이다. 실험 결과 흑미 추출물의 단백 질 함량이 4900 μg/mL로 가장 높게 나타났고, 향찰현미 추출물의 단 백질 함량이 3700 μg/mL로 가장 낮았다. 단백질 함량이 낮다는 의미 는 향찰현미 중 단백질이 아미노산으로 처리된 함량이 많다는 것을 의 미한다. 각각의 특수미를 사용하여 총 고형분 함량을 4%로 제조하였 을 때, 단백질 함량은 0.37~0.49%였으며, 이중 흑미 추출물이 0.49% 로 가장 높게 나타났다. Ha 등의 연구에서도 흑미 품종의 단백질 함량 이 일반 현미에 비해 높은 편으로 보고되어[24], 본 연구 결과와 유사 하였다.

3.3. DPPH법을 이용한 free radical 소거 활성

DPPH는 매우 안정한 free radical로서 517 nm에서 특징적인 광흡수 를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH는 알코올 등의 유기용매에 매 우 안정하며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되 기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있다는 장점이 있 어 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다[25]. 유해산소라고 불리는 활성산소는 세포 생체막의 구성성분 인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 색소 침착, 노 화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다[26].

품종별 쌀단백질 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH radical 소거활성 실험을 진행하였으며, 그 결과를 Figure 5에 나타내 었다. 6종의 모든 추출물에서 항산화 활성이 관찰되었으며, 특히 흑미 추출물과 홍현미 추출물이 2 mg/mL에서 80.0% 이상의 우수한 DPPH radical 소거활성을 나타내었다. 이전의 연구에서 흑미의 메탄올 추출 물이 백미의 메탄올 추출물보다 DPPH radical을 이용한 측정에서 높 은 활성을 나타내었다고 보고하였고[27, 28], polyphenolic 화합물 중 flavonoid 계열 화합물의 DPPH radical을 이용한 측정에서 우수한 항 산화력이 있음을 보고하였다[29]. 본 실험결과 측정된 흑미와 홍현미 추출물의 우수한 DPPH radical을 이용한 전자공여능은 흑미와 홍현미 에 다량 존재하는 항산화 물질들과 연관이 있을 것으로 생각된다.

3.4. ABTS radical 소거 활성 측정

ABTS법은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS⁺이 시료 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 탈색되는 것을 이용한 항산 화능 측정 방법으로 DPPH assay의 경우 자유라디칼을 소거하는 반면, ABTS는 양이온 라디칼을 제거하는 차이를 가지고 두 기질과 반응물 과의 결합 정도가 달라져 라디칼 제거 능력의 차이를 보인다[30]. ABTS radical 소거활성을 분석한 결과는 Figure 6과 같으며, DPPH 라 디칼 소거능과 유사한 경향을 보였다. 품종별 쌀 추출물의 0.5, 1.0 및 2.0 mg/mL 농도에서 ABTS radical scavenging activity는 농도 의존적 으로 증가하는 경향을 나타내었고, 이러한 결과는 쌀 추출물이 함유 한 총 페놀 성분의 증가로 인한 것으로 사료된다. 특히 흑미 추출물과 홍현미 추출물이 2 mg/mL에서 70.0% 이상의 우수한 ABTS radical 소거활성을 나타내었다. 이러한 결과는 백미에 비해 유색미에 함유되 어 있는 안토시아닌, 탄닌계열 색소에 의해 총 페놀함량이 높게 나타 났고, 이에 따라 항산화 활성 또한 우수하다는 Kim 등의 연구결과와 일치하였다[31]. 따라서 본 연구에서도 페놀화합물과 안토시아닌을 다량 함유하고 있는 고기능성 유색미 품종인 흑미에서 항산화 활성이 가장 우수하게 나타난 것으로 판단되며, 이러한 특성은 항산화를 비 롯한 다양한 생리활성에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 생각된다.

3.5. 수분보유력 평가

품종별 쌀 추출물의 보습력 평가 결과를 Figure 7에 나타내었다. 시 험 결과 홍현미, 홍찰현미, 흑미, 향찰현미를 이용한 추출물들이 수분 보유력 110.0% 이상의 효능을 지닌 것을 확인하였고, 이는 히알루론 산의 104.9%와 비교하여 우수한 효과가 있는 것을 확인하였다. 수분 보유력이 우수한 소재는 피부 각질층에서 수분을 다량 함유하고 수분 증발을 감소시키는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 피부 회복력을 증가 시키므로 피부 보습에 우수한 효과를 기대할 수 있다. 일반적으로 쌀 단백질은 동물성 단백질을 직접적으로 대체할 수 있는 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 백미와 미강, 유색미에 함유되어 있는 단백질 은 모두 수분을 잡아두는 능력이 있으며[32], 이러한 특징을 이용하여 보습용 화장품 등에 적용가능한데, 쌀단백질 추출물 적용 시 수분 함 유 증가량만큼 원료를 절감할 수 있다는 장점이 있고, 미강단백질의 경우 유화력이 우수한 특성을 지니고 있으므로 로션, 크림과 같은 유 화형 화장품 제형에도 충분히 사용 가능하다고 생각된다.

4. 결 론

본 연구는 청원지역에서 재배하고 있는 6품종의 쌀을 당 분해 효소 및 단백질 분해 효소를 이용하여 쌀단백질 추출물을 제조하여 단백질 함량, 항산화 효과 및 수분보유력을 비교 분석하였다.