1. 서 론
산화철 나노입자는 외부 자기장에 반응하여 나노 자성체의 배열이 달라지는 초상자성의 특성을 가진다. 초상자성 특성은 세균이나 조류 의 뇌에서 지구의 자기장을 감지하는 기능을 제공하고, 자기 저장 매 체에서 데이터를 자력의 방향으로 기록하게 해준다[1]. 초상자성의 나 노입자는 외부의 교류 자기장에 따라 진동하므로, 이를 의료용으로 응용하여 고주파 교류 자기장을 이용하여 산화철 나노입자를 흡수한 암세포를 가열시켜 사멸시킬 수 있다[2]. 산화철 나노입자는 조직 형 성이 불완전한 암에 침투하여 축적되거나, 표면을 수식하여 특정 암 세포에 선택적으로 흡착시켜 치료와 진단이 동시에 가능한 테라그노 시스의 소재로 응용된다[3]. 특히 핵자기공명장치의 조영제로 사용하 여 많이 연구되었으며[4], 화학적인 합성법부터 금속 열분해까지 다양 한 제조방법이 개발되어 지름이 1~100 nm인 균일한 산화철 나노입 자를 얻을 수 있다[5]. 산화철 나노입자는 그대로 사용하기도 하지만, 분산성을 개선하거나[6], 약물전달을 개선하기 위하여[7] 혹은 외부 자기장을 사용하여 약물을 전달하거나, 암세포를 표적화하는 등의 목 적으로 주로 미세캡슐화 되었다[8]. 캡슐화 혹은 코팅은 산화철 나노 입자의 변형이나 손실 혹은 응집을 방지하고 흡착이나 화학적인 결합 으로 의약품을 운반하는 기능을 제공할 수 있으며, 생체친화적 물질 을 사용하여 독성이나 부작용을 줄이고 저농도로 표적 지향적 약물전 달을 할 수 있다[9].
산화철 나노입자는 목적에 따라 표면을 화학적으로 수식하거나, 마 이크로캡슐화 되어 코어 셸 형태로 의료분야에 응용되고 있다. 그러 나 실험동물의 정맥으로 주입된 산화철 나노입자나 산화철의 마이크 로캡슐은 일부가 간 및 비장에 축적되었고, 2 week 후에도 완전히 제 거되지 않았다[10]. 이처럼 실험동물 수준에서 산화철 나노입자의 분 포나 거동은 연구되었으나, 세포 조직수준에서 산화철 입자의 미세 거동은 보고된 바 없는 편이다.
따라서 본 연구에서는 산화철 나노입자를 캡슐화 시켜 세포내로 침 투시켰고, 자석으로 부상시켜 배양하였고, 산화철 입자의 거동을 조사 하였다. 마이크로캡슐화 소재로 사용된 피브로인은 실크섬유를 구성 하는 불용성 단백질이며[11], 피브로인 미세구는 높은 효율로 세포에 흡수된다[12]. 산화철 마이크로캡슐을 배양된 섬유아세포에 침투시키 고 자력부상 배양으로 얻어진 세포집합체 내부에서 산화철 나노입자 의 거동을 조직화학염색 및 마이크로CT로 조사하였다. 이로부터 생체 조직내부에서 자력에 반응하는 마이크로캡슐의 거동을 예측할 수 있 는 결과를 제시하였다.
2. 실 험
2.1. 실험재료
본 연구에 사용된 실크 피브로인은 화인코(Chuncheon, Korea)에서 제공받았다. 산화철 나노입자(Aldrich 637106, 50~100 nm in diameter) 및 sorbitan monooleate (Span 80), polyoxyethylene 20 sorbitan monooleate (Tween 80), n-decane, dimethyl slufoxide (DMSO), propidium- iodide (PI)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
2.2. 산화철 나노입자의 마이크로캡슐화
동결건조된 피브로인을 증류수에 녹여 0.5 wt% 수용액을 5 mL를 만들고, 산화철 40 mg을 첨가 후 3 min간 초음파 처리하였다. 제조된 시료에서 산화철 침전을 제외하고 4 mL를 취하여 3.5 wt% 실크 피브 로인 수용액 4 mL와 혼합하였다. 여기에 decane 16 mL에 계면활성제 인 span 80 (2.2 mL)와 tween 80 (1.8 mL)이 혼합된 유기상 용액을 첨가하고, 고속균질기(Polytron PT 2100, Kinematica, Switzerland)를 이용하여 30,000 rpm에서 1 min간 처리하여 W/O 에멀젼을 제조하였 다. 이어서 회전 진공 건조기(Eyela, N-1110 series, Rikakikai, Japan)로 40 ℃에서 30 min간 감압 건조했다. 수분이 제거된 시료는 4,000 rpm 으로 5 min간 원심 분리하여 상등액을 제거하고, 에탄올로 원심 세척 을 반복하여 잔류 decane을 세척하였다
2.3. 산화철 마이크로캡슐의 분석
산화철 마이크로캡슐은 1 mg/mL의 현탁액을 초음파 처리하여 완 전히 분산시킨 후 유리병에 넣어 외부 벽면에 자석을 붙여 자력 반응 을 관찰하였다. 마이크로캡슐의 산화철량을 측정하기 위하여, 열중량 분석기로 공기 조건에서 50 ℃부터 600 ℃까지 10 ℃/min의 속도로 온 도를 올려 분석하였다. 피브로인 마이크로캡슐을 대조군으로 산화철 의 양을 wt%로 환산하여 비교하였다. 자력계(vibrating sample magnetometer, Cryotronics, USA)를 사용하여 산화철 마이크로캡슐의 자력 반응을 측정하였다. 자기장의 세기를 104 Oe까지 변화시키며, 피브로 인 마이크로캡슐과 산화철 및 산화철 마이크로캡슐의 자기이력 곡선을 측정하였다.
차례로 희석한 산화철 마이크로캡슐 분산액을 카본테이프가 부착된 전자현미경 시편 대에 올리고 건조하였다. 건조된 마이크로캡슐 시료 는 sputter (E-1010, Hitachi, Japan)로 백금 코팅 후 15.0 kV에서 고분해 능 주사전자현미경(UHR-SEM; S4800, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰 하였다. 분산액을 그리드를 사용하여 투과전자현미경(TEM; JEM-2010, JEOL, Japan)으로 마이크로캡슐 내부를 관찰하였다.
2.4. 세포배양
마우스 섬유아세포 BALB/3T3 clone A31은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. 3T3 세포는 fetal bovine serum (FBS; Lonza, NJ, USA) 10%, penicillin/streptomycin (Lonza)을 1% 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 12-604 (DMEM, Lonza)를 사용하여 37 ℃, CO2 5% 조건에서 배양하였다. 세 포 증식을 확인하기 위하여 배지를 제거하고, 차가운 인산완충용액 (PBS, pH 7.4, GIBCO)으로 세척하고, 트립신(Lonza 17-161) 1 mL를 첨가하여 분리된 세포를 혈구계수기를 사용하여 계수하였다. 세포의 생존율은 tryptan blue를 첨가하여 염색되는 세포의 비율을 계수하거나, 유속세포분석기(FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 를 사용하여 PI 형광을 나타내는 세포의 비율로 계산하였다. 이를 위 하여 트립신을 처리하여 분리된 세포를 인산완충용액에 재현탁시키 고, PI를 최종농도가 2 μg/mL가 되도록 첨가하여 4 ℃, 암조건에서 30 min 동안 염색하였다.
2.5. 자력부상 배양
세포가 24 h 동안 배양된 배양접시(100 × 20 mm)에 고압멸균기로 살균한 산화철 마이크로캡슐 현탁액(1 mg/mL) 1 mL를 첨가하였다. 이어서 24 h 배양하고, 트립신을 첨가하여 세포를 배양접시에서 분리 하고 원심분리기를 이용하여 700 rpm으로 3 min간 원심분리하여 회수 하였다. 회수된 세포를 새로운 배지에 재현탁하여 배양접시(petri dish 60 × 15 mm, SPL, Korea)로 이동하였다. 이동된 세포들은 2개의 둥근 네오디뮴 자석(30 × 4 mm)을 2개 배양접시의 상단에 올려놓고 배양 되었다. 자석의 바닥에서 배양액의 표면까지 간격은 10 mm, 바닥까지 는 15 mm이다. 세포들은 2~3 day마다 새로운 배양접시로 이동시키거 나 새로운 배지로 갈아주었다.
2.6. 세포조직의 처리 및 절단면 분석
자력부상 배양된 세포집합체는 인산완충용액으로 1 min간 세척 후 4%의 formaldehyde/PBS에 24 h 동안 냉장 보관하여 고정하였다. 이 어서 냉장 보관한 에탄올에 2 h, 50% 에탄올에 2 h, 70% 에탄올에 4 h, 95% 에탄올에 2 h 그리고 100% 에탄올 용액으로 옮겨서 수분을 제거하였다. 이어서 xylene 용액에 옮기고, 60 ℃에서 액화된 파라핀 에 넣어 포매시켰다. 파라핀 포매 시료는 회전식 미세절편기(RM2245, Leica, Germany)로 5 μm 두께 조직 절편으로 절삭하고, 슬라이드 글 라스 위에 올려놓고 건조하였다. 시료에 존재하는 파라핀을 제거하기 위하여 2회에 걸쳐 xylene에 5 min간, 3회에 걸쳐 100% 에탄올에 3 min간, 2회에 걸쳐 95% 에탄올에 3 min간, 70% 에탄올에 3 min간, 증 류수에 5 min간 처리하였다. 재수화된 시료는 Haematoxylin and Eosin (H&E) 시약으로 염색하고 광학현미경으로 관찰하였다.
2.7 Micro-CT를 이용한 산화철 분포
조직 시료를 냉장 PBS로 1 min간 세척한 후 4%의 formaldehyde/ PBS로 4 ℃에서 24 h 동안 고정하였다. 고정이 끝난 시편은 미세전산 단층촬영 시스템(three dimensional micro focus computed tomography; microCT, Sky-scan 1172TM, Skyscan, Kontich, Belgium)을 이용하여 스캔하였다. 이미지 분석 소프트웨어(CTanalyzer, Skyscan, kontich, Belgium)와 image J 소프트웨어를 이용하여 2, 3차 이미지를 얻었다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 산화철 나노입자의 마이크로캡슐화
산화철 나노입자 10 mg을 2 wt% 피브로인 용액 8 mL에 넣어 초음 파로 분산시키고, 데칸과 유화제를 첨가하여 유상수적의 에멀젼을 형 성시킨 후 감압 건조하여 마이크로캡슐을 제조하였다. Figure 1(a)는 제조된 산화철 마이크로캡슐의 투과전자현미경 사진이며, 마이크로캡 슐 내부에 산화철 나노입자[Figure 1(b)]와 크기와 모양이 유사한 입자 가 관찰되었다. 피부로인 마이크로캡슐은 원래 백색 분말인데, 산화철 마이크로캡슐은 갈색 분말로 수용액에 분산시키면 반투명의 갈색 현 탁액이 얻어졌다. Figure 1(c)는 산화철 마이크로캡슐 현탁액의 사진 이며, 현탁액 바이알 벽면에 자석을 갖다 대면 현탁액의 입자는 자석 으로 끌어 당겨져 모였다[Figure 1(d)].
산화철 마이크로캡슐의 주사현미경 사진 Figure 2(a)와 피브로인 마 이크로캡슐의 사진 Figure 2(b)에서 입자의 크기나 분포는 큰 차이는 관찰되지 않았다. 산화철 마이크로캡슐의 수평균 직경은 0.73 μm이 고, 중량평균 직경은 1.63 μm이었다. 산화철 마이크로캡슐의 표면은 덜 매끄러워 보이고 구형 정도는 다소 감소한 것으로 관찰되었다. 열 중량 분석에서 통하여 산화철의 함량은 피브로인 중량의 4.28%로 나 타났다[Figure 2(c)]. 피브로인 마이크로캡슐, 산화철 및 산화철 마이 크로캡슐의 자력 모멘트값은 각각 -1.06, 77.0와 3.94 emu/g으로 측정 되었다. 산화철 마이크로캡슐의 자력 모멘트는 산화철 나노입자의 5.11%이었다[Figure 2(d)]. 위 결과로부터 산화철 나노입자가 피브로 인 단백질로 마이크로캡슐화 되었음을 확인하였다.
제조과정에서 피브로인 중량의 6.25%에 해당하는 산화철 나노입자 를 첨가하였으나, 열중량 분석 산화철 함량은 4.28%로 캡슐화 효율은 68.5%이다. 마이크로캡슐을 제조하는 과정에서 손실이 발생한 것으 로 보인다. 제조과정에서 산화철 나노입자는 0.5% 피브로인 수용액에 초음파 처리 분산시켜 피브로인과 물리적으로 흡착시켰다. 단백질 분 자의 기능기와 산화철 나노입자의 표면과 적절한 화학 결합을 만들면 캡슐화 효율을 높일 수 있을 것으로 예상된다. 산화철 나노입자는 주 로 표면의 화학적 개질을 통하여 생체접합성 표적 지향성 및 분산 안 정성 같은 생체 진단 및 치료에 적합한 기능을 추가하지만, 다양한 폴 리머 매트릭스로 캡슐화 시키는 방법의 장점도 많다[13]. 본 연구에서 사용한 단백질 폴리머인 피브로인은 EDTA나 구연산 같은 저분자물 질처럼 산화철 나노입자의 표면을 완전히 캡핑 시킬 수 없으나, 약물 을 포집할 수 있는 공간을 제공할 수 있고 용이하게 표면을 수식할 수 있게 많은 기능기를 가지고 있다. 피브로인 마이크로캡슐은 제조 과정에서 화학적 수식을 사용하지 않아 순수한 단백질 표면을 유지하 며, 마이크로캡슐은 세포 내로 흡수되고 배출되지만, 세포 독성이 낮 고, 첨가량이 적으면 세포의 증식을 촉진하는 특성을 갖는다[14].
3.2. 자력부상 배양
배양된 3T3 세포에 산화철 마이크로캡슐의 최종농도가 0.1 mg/mL 되도록 첨가하고 네오디뮴 자석 위에서 24 h 배양하고 tryptan blue 색 소배제법으로 생존율을 측정하였다(Figure 3). 마이크로캡슐을 첨가하 고 자력하에서 생존율은 82.3 ± 5.8%, 마이크로캡슐만 첨가하면 77.3 ± 8.8%였다. 자력만 존재하면 생존율은 83.7 ± 2.9%이었다. 산화철 마이크로캡슐을 첨가고 동시에 자력이 존재하는 조건에서도 색소배 제법 생존율은 대조군의 79.7 ± 3.4%보다 감소하지 않았다. 따라서 산화철 마이크로캡슐이 첨가된 3T3 세포의 자력부상 배양을 시도하 였다. 산화철 마이크로캡슐을 24 h 배양된 3T3 세포 배양액에 첨가하 고, 추가로 24 h 배양하였다. 여기에 트립신을 처리하여 세포 현탁액 을 얻었다. 세포 현탁액은 자력에 반응하여 맑게 변하고, 세포 대부분 은 자석 방향으로 응집하였다. 회수한 5~7 × 105의 세포를 비부착성 배양접시(60 mm)에 넣고, 네오디뮴 자석을 올려 자력부상 배양하였 다[Figure 4(a)]. 자력 하에서 세포들은 배양액의 표면에 부유하고 3 day 후에는 하나의 세포 집합체를 형성하였다. 산화철 마이크로캡슐 과 자력이 세포의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 각각의 단계에 세포를 PI로 염색하고 유속세포기로 분석하였다. Figure 4(b) 는 단층배양에서는 산화철 마이크로캡슐의 첨가 여부와 무관하게 세 포의 생존율이 모두 95%임을 보여주었다. 자력부상 배양 시 세포의 생 존율은 초기 88.5%에서 시작하여 95% 이상 유지되어 170 h에 93.4% 로 나타났다. 반면 배지를 교환하지 않았거나 혈청이 포함되지 않은 배지를 사용하면 생존율은 96 h에 50% 이하로 감소하였다. Figure 4(c)는 자력 하에서 배지의 표면 가까이 떠올라 배양되는 3T3 세포 집 합체의 사진이다. 회수한 세포집합체는 비대칭인 타원체에 가까운 형 태를 가졌고 장축의 길이는 2 mm이었다[Figure 4(d)].
자력부상 배양된 세포집합체를 포르말린으로 고정하고 탈수와 에 폭시 포매를 거쳐 제작한 절편을 투과전자현미경으로 관찰하였다 (Figure 5). 산화철 마이크로캡슐의 크기에 해당하는 구형의 입자가 세포질에 분포하고 있으며, 확대된 이미지의 구형 입자의 내부에는 산화철 나노입자에 해당하는 검은 점(화살표)도 여럿 관찰되었다. 각 각의 세포들은 서로 인접하게 접촉하고 있어 생체 조직의 단면과 유 사한 형태를 나타내었다. 투과 전자현미경 사진으로부터 산화철 마이 크로캡슐을 흡수하거나 흡착한 세포가 자력부상 배양되었음을 확인 하였다. 산화철 마이크로캡슐이 첨가되어도 세포의 생존율 감소는 관 찰되지 않았고, 세포는 자력으로 액체 표면에 떠오르고 서로 응집하 여 구형의 세포집합체를 형성하였다. 산화철 마이크로캡슐을 첨가하 지 않는 대조군에서는 세포의 표면 부상은 물론 세포응집체 역시 관 찰되지 않았다.
산화철 나노입자를 응용한 자력부상 세포배양은 여러 방법이 보고 되었으며, 산화철 마이크로캡슐을 이용한 자력부상 배양은 수 밀리미 터의 직경을 가진 세포집합체를 형성하였다[15]. 최근에는 산화철 나 노입자를 흡수한 신경세포를 자석으로 유도하여 알츠하이머 같은 뇌 질환을 치료하는 연구도 보고되었다[16]. 따라서 자력을 이용한 세포 배양은 2차원 평면인 배양접시의 바닥으로부터 3차원적인 환경으로 전환 가능하게 하였고, 자력을 조절하여 생물학적 빌딩 블록의 자기 조립이나 조직 공학 제품의 제조 및 진단 목적의 세포 집합체를 얻는 여러 응용 분야에서 가능성을 갖고 있다[17]. 반면에 세포 내부로 흡 수된 산화철 나노입자나 산화철 마이크로캡슐의 미세 거동에 관한 연 구는 많지 않다. 따라서 본 연구에서는 3차원으로 배양된 세포집합체 의 내부의 산화철 마이크로캡슐의 분포와 형태를 추적하였다.
3.3. 산화철 마이크로캡슐의 거동 분석
구형의 세포집합체의 내부를 관찰하기 위하여 파라핀으로 고정하 고 절편으로 제작하였다. Figure 6(a)는 H&E로 염색한 파라핀 절편의 사진이다. 구형의 세포집합체는 H&E로 짙게 염색된 약 200~300 μm 의 바깥층과 내부로 구분된다. 내부의 세포들은 핵의 크기가 작고 약 하게 염색되었으며 바깥층과 사이에 빈 분리된 구조가 관찰되었다. Figure 6(b)는 바깥층을 확대한 사진이다. 균일한 크기의 세포와 갈색 의 산화철 마이크로캡슐이 짧은 체인 형태로 존재하는 것이 관찰되었 다. 산화철 마이크로캡슐 체인의 길이는 5~20 μm의 범위이며, 모두 자력의 방향으로 배열되어 있다. 산화철 마이크로캡슐 체인은 자력과 평행한 방향으로 잘라진 절편 시료에서만 관찰된다. 다른 절편 시료 에서는 산화철 마이크로캡슐은 산발적으로 흩어져 있는 상태로 관찰 되었다. 따라서 산화철 마이크로캡슐은 외부 자력에 반응하여 세포집 합체 내부에서 체인 형태로 배열되는 것처럼 보인다. 세포집합체를 마이크로CT로 촬영하여 3차원으로 재구성하였다(Figure 7). 세포집합 체의 부피는 63.7 mm3으로 측정되었으며 이중 산화철 나노입자가 차 지하는 공간은 4.1 mm3으로 6.4%에 해당한다. 재구성한 3차원 마이 크로CT 이미지에서 산화철 입자가 세포집합체의 한쪽으로 치우쳐 비 대칭적으로 분포하고 있음을 관찰할 수 있다.
자력부상 배양된 3차원 세포집합체의 내부는 물질전달 제한으로 인 하여 영양물질의 공급이 세포의 사멸이 보여준다. 물질전달의 제한이 없는 바깥층의 두께는 200~300 μm이며, 에오신으로 짙게 염색되어 단백질의 함량이 많고 세포의 대사활성이 높다는 것을 보여준다. 자 기장하에서 산화철 나노입자가 체인을 형성하는 현상은 잘 알려져 있 고, 합성을 통하여 다양한 크기의 나노체인과 나노다발을 만드는 방 법도 보고되었다[18]. 상자성체인 산화철 나노입자가 자력의 순방향 으로 배열하여 나노자석 형태로 서로 잡아당기기 때문이다. 세포집합 체는 산화철 마이크로캡슐을 흡수한 세포 현탁액으로부터 자력부상 배양되었으나 내부의 산화철 분포는 균일하지 않았다. 이는 자력에 의하여 산화철 마이크로캡슐이 세포집합체 내부에서 자력의 방향으 로 이동하거나, 산화철 마이크로캡슐을 더 많이 흡수한 세포가 자력 의 방향으로 빨리 모였기 때문일 수 있다.
4. 결 론
기존의 피브로인 미세구를 제조하는 방법을 수정하여 산화철 나노 입자가 포함된 산화철 마이크로캡슐을 제조하였다. 산화철 마이크로 캡슐은 세포내 흡수되어 자력으로 세포가 이동하거나 모여 응집하게 할 수 있어, 자력부상 배양으로 3차원 세포집합체를 얻었다. 세포집합 체 내부의 산화철 분포는 비대칭적으로 자석의 방향으로 치우쳐져 있 으며, 마이크론 크기의 산화철 마이크로캡슐도 자력의 유도로 마이크 로캡슐들이 연결된 체인을 형성하였다. 본 연구에서는 마이크로캡슐 화 된 산화철을 이용하여 세포를 자력으로 이동시킬 수 있음 보였다. 따라서 외부의 자력을 조정하여 산화철 마이크로캡슐과 같이 배양시 킨 세포를 신체의 특정 부분에 모으거나 추적하는 등의 목적에 응용 가능성을 제시하였다.
