1. 서 론

현대사회에서는 많은 사람들이 건강과 미용에 대한 관심이 점점 높 아지고 있다. 특히, 노화를 방지시켜주는 항산화물질에 관심이 많다. 항산화물질은 인체의 호흡 또는 외부자극으로 과도하게 생성되는 활 성산소로 인해 세포들이 산화되는 것을 방지하는 물질이다. 항산화물 질에는 카로티노이드류, 플라보노이드류, 이소플라본류, 비타민 등이 있다. 항산화물질은 일반적으로 식물에 많이 함유되어 있다. 그중 민 들레(dandelion leaves)는 한국, 중국, 일본 등 아시아지역에서 흔하게 볼 수 있는 여러해살이풀이다. 민들레는 예로부터 간과 혈당조절을 돕는 약재로 사용되었고, 현대에 들어와서도 항산화물질이 많은 식물 로 활발한 연구가 진행되고 있다. 민들레의 대표적인 효능은 해독, 면 역력 증진, 성인병 예방 등이 있다[1-3].

반응표면분석법(response surface methodology, RSM)이란 실험계획 법의 일종으로 최소한의 실험으로 최대의 정보를 어떻게 얻을 수 있 을 것인가에 대한 계획방법이다. 이는 실험계획법에 따라 얻은 데이 터를 적절한 모델함수에 적합화 시키는 수리 통계적 기술이다. 반응 표면분석법은 서로 다른 독립변수인 계량인자(quantitative factor, X)들 이 반응치(response, Y)에 영향을 주고 있을 때 계량인자의 변화가 이 루는 반응표면에 대한 통계적인 분석을 통해 반응치를 예측한다. 반 응표면분석법의 대표적인 모델로는 중심합성계획모델(central composite design model, CCD)과 Box-Behnken 설계모델(Box-Behnken design model, BBD) 등이 있다[4-8]. 이 중 Box-Behnken 설계모델은 3개 이상의 계량인자를 필요로 하며, 각 계량인자는 Figure 1에서와 같이 입방체의 정중앙과 모서리 중앙에 위치하여 계량인자가 반응치에 미 치는 영향을 반응표면에 나타내고, 통계적인 분석을 통해 다음과 같 이 반응치와 각 계량인자의 관계를 보여준다.

여기서 Y는 반응치를 나타내고 X는 서로 다른 계량인자이며, C는 고유상수이다. 고유상수는 어느 계량인자의 주효과도와 교호효과가 큰지 판별하게 해준다. 위 식에서 일차항은 주효과도를 뜻하고, 서로 다른 계량인자로 이루어진 이차항은 교호효과도를 나타낸다. 위의 회 귀방정식에서 하나의 계량인자 값을 고정하여 3차원 그래프를 도식화 하면 나머지 두 계량인자의 경향성을 파악할 수 있고, 두 계량인자 값 을 고정하면 2차원 그래프를 도식화하여 하나의 계량인자가 반응치에 미치는 영향을 볼 수 있다.

따라서 본 연구에서는 열수추출법과 초음파 추출법을 통해 민들레 의 항산화성분의 함량을 알아보고 수율과 항산화성분인 플라보노이 드 함량의 최대화를 목표로 하여 실험조건의 최적화를 진행하였다. 추출의 최적화는 반응표면분석법 중 Box-Behnken 설계모델을 사용하 였다. 열수추출법의 경우 추출온도, 주정/초순수 부피비, 추출시간을 계량인자로 설정하였으며, 초음파 추출법의 경우 초음파 조사세기, 주 정/초순수 부피비, 초음파 조사시간을 계량인자로 설정하였다.

2. 실험방법

2.1. 항산화성분의 추출공정

본 연구에서는 민들레로부터 항산화성분을 추출하기 위해 전통적 인 열수추출법과 초음파 추출법을 이용하였다. 열수추출법은 용매와 용질을 혼합하여 용액을 만든 후, 직접 가열방식으로 가열, 교반하여 유효성분을 추출하는 방법이다. 또한 초음파 추출법은 용액에 초음파 를 조사하여 가열 및 교반하는 방식으로 유효성분을 추출하는 방식으 로 추출시간을 단축시킬 수 있다. 본 연구에서는 민들레에 포함되어 있는 항산화성분인 플라보노이드 성분을 추출하기 위해 주정과 초순 수를 일정한 부피비로 혼합하여 용매로 사용하였다. 혼합용액 500 mL 를 기준으로 분쇄된 민들레 잎 5 g으로부터 항산화성분을 추출하였다. 추출된 유효성분의 수율은 냉동건조법(freeze drying method)을 이용 하여 측정하였다. 민들레로부터 추출된 유효성분은 여과과정을 거친 후 진공증류를 통해 농축하여 -10 ℃로 6 h 동안 1차 동결한다. 동결 된 시료는 냉동건조장치(LP3, Jouan, France)에서 0.1 mbar, -40 ℃의 조건으로 24 h 건조하여 질량을 측정한 후 수율을 계산하였다.

2.2. 항산화성분 분석

본 연구에서는 항산화성분 분석을 위해 자외선 분광광도계를 사용 하여 민들레 추출물에 포함되어있는 플라보노이드 함량(total flavonoids) 을 측정하였다. 먼저 표준물질인 quercetin (Sigma-Aldrich, Q4951)을 이용하여 검정곡선을 작성하였다. 검정곡선은 415 nm의 자외선 파장 에서 표준용액의 농도범위를 10~80 μL/mL로 설정하여 작성되었다. 항 산화성분인 플라보노이드 함량의 정량을 위해 냉동 건조한 시료용액 1 mL (1 mg/mL)에 10% aluminum nitrate 0.1 mL와 1 M potassium 0.1 mL를 혼합한 후 메탄올을 이용하여 총부피를 5 mL로 제조하였 다. 제조된 시료는 암실에서 40 min 방치한 후 자외선 분광광도계를 이용하여 정량하였다. 측정된 흡광도는 검정곡선을 이용하여 quercetin equivalents (mg QE/mL dw)로 환산하였다[9,10].

3. 결과 및 고찰

3.1. 열수추출법의 최적화

열수추출법을 통해 민들레에 함유되어있는 항산화성분의 추출 최 적화 조건을 찾기 위해 Box-Behnken 설계모델이 제시하는 15개의 조 건에 대해서 실험을 진행하였다. 공정의 최적화를 위해 계량인자는 추 출온도, 주정/초순수 부피비, 추출시간을 계량인자로 설정하였고, 반 응치로는 추출수율과 플라보노이드 함량을 설정하였다. Box-Behnken 설계모델을 통해 각 반응치와 계량인자의 관계를 보여주는 식은 다음 과 같다.

여기서 Y는 수율이고, X₁은 추출온도, X₂는 주정/초순수 부피비, X₃은 추출시간이다. 회귀방정식은 각 계량인자의 주효과도와 교호효 과도를 나타내는 2차원의 식으로 표현된다. 그리고 Figure 2는 회귀방 정식을 이용하여 3차원 그래프와 그것을 위에서 바라본 등고선도로 나타낸 것이다. 회귀방정식, 그래프, p-value와 f-value를 통해 각 계량 인자의 주효과도를 알 수 있다. 회귀방정식에서 일차항 계수의 크기 가 클수록 주효과도가 크다. 식 (2)에서 일차항은 추출온도(X₁), 주정/ 초순수 부피비(X₂), 추출시간(X₃)이고, 계수의 크기는 X₃(13.09), X₁ (1.498), X₂(0.463) 순으로 크게 나타났다. 이로부터 도시된 그래프의 기울기가 클수록 등고선이 조밀하게 생성되어 등고선이 조밀도를 이 용하여 주효과도를 설명할 수 있다. 또한 반응표면분석 결과 추출시 간의 p-value는 0.002이고, f-value 37.27이었으며, 주정/초순수 부피비 와 추출온도는 비슷한 수준이다. p-value는 귀무가설이 맞다고 가정할 때 얻은 결과보다 극단적인 결과가 실제로 관측될 확률을 뜻하는 유 의 확률이다. 일반적으로 p-value가 0.5보다 작으면 그 실험은 타당한 것으로 판단한다. f-value는 그 값이 클수록 중요한 계량인자임을 뜻 한다. 따라서 p-value가 작을수록, f-value가 클수록 실험의 타당성을 대변한다[11-13]. 위의 결과들을 종합하여 주효과도는 추출시간, 추출 온도, 주정/초순수 부피비 순으로 큰 것을 알 수 있었다. 교호효과도는 회귀방정식에서 두 가지 계량인자가 곱해진 형태로 나타나며, 식 (2) 에서 X₁X₃(0.039), X₂X₃(0.005), X₁X₂(0.00275) 순으로 크게 나타나 (추출온도 × 추출시간), (주정/초순수 부피비 × 추출시간), (추출온도 × 주정/초순수 부피비) 순으로 교호효과가 큰 것을 알 수 있었다. 반응 표면분석 결과 (추출온도 × 주정/초순수 부피비)의 p-value는 0.138로 가 장 크고, f-value는 4.24로 가장 크다. 따라서 (추출온도 × 추출시간), (주정/초순수 부피비 × 추출시간), (추출온도 × 주정/초순수 부피비)의 순 으로 교호효과도가 수율에 미치는 교호효과도가 크게 나타났다.

다음의 식 (3)은 계량인자들과 항산화성분인 플라보노이드 함량의 관계를 보여준다.

여기서 F는 플라보노이드 함량이고, X₁은 추출온도, X₂는 주정/초 순수 부피비, X₃은 추출시간이다. Figure 3은 회귀방정식을 이용하여 계량인자에 따른 플라보노이드 함량의 변화를 3차원 그래프와 그 등 고선도로 나타낸 그림이다. 앞에서와 같은 방식으로 계량인자의 주효 과도를 알 수 있다. 식 (3)에서 일차항의 계수는 X₃(26.7), X₁(2.81), X₂ (0.913) 순으로 그래프에서도 기울기가 가파르고, 등고선이 조밀하게 나 타났다. 또한 반응표면분석 결과 추출시간의 p-value는 0.004로 계량 인자 중에서 가장 작고, f-value는 26.05로 가장 크게 나타나 주효과도 의 크기는 추출시간, 추출온도, 주정/초순수 부피비순으로 큰 것을 알 수 있었다. 계량인자의 조합으로 이루어진 교호효과의 경우 회귀방정 식의 X₁X₃(0.02), X₂X₃(0.02), X₁X₂(0.002) 순으로 크게 나타났다. 또 한 반응표면분석의 결과 (주정/초순수 부피비 × 추출온도)의 p-value는 0.03, f-value는 16.79로 가장 크다. 따라서 플라보노이드 함량에 큰 영 향을 미치는 교호효과도는 (추출온도 × 추출시간)과 (주정/초순수 부 피비 × 추출시간)이었다.

Figure 4는 반응치를 95% 신뢰구간과 실험값을 보여주는 확률도이 다. 그래프의 점들이 실제실험의 반응치이고, 선분은 왼쪽부터 낮은 반응치, 중간 반응치, 높은 반응치를 나타낸다. 모든 점들이 선분들 안 에 둘러싸여 있는 조밀한 형태를 보임으로 신뢰도는 95% 이상으로 상당히 높다는 것을 알 수 있었다.

Figure 5는 각 계량인자에 따른 각 반응치의 최적화 그래프와 두 개 의 반응치를 모두 고려한 최적화 그래프이다. 모든 계량인자가 증가 할수록 반응치는 증가하다 감소하는 경향을 볼 수 있다. 그래프의 기 울기를 통해 각 반응치인 수율, 플라보노이드 함량에 미치는 영향은 추출시간, 주정/초순수 부피비, 추출온도 순으로 알 수 있었다. 그래프 에서 빨간색 세로선은 최적화 설계가 이루어진 지점이다. 수율과 플 라보노이드 함량 모두 만족시키는 계량인자의 조건은 추출온도 45.76 ℃, 주정/초순수 부피비 41.92 vol.%, 추출시간 1.75 h에서 수율은 21.74 wt.%, 플라보노이드 함량은 30.67 mg QE/mL dw을 나타났다. 반응표면분석법을 통한 최적조건에서 여러 번의 실험을 진행한 결과 오차범위는 3% 미만으로 나타났다. 따라서 반응표면분석법이 신뢰할 수 있는 프로그램임을 확인하였다.

3.2. 초음파 추출법 최적화

초음파 추출법의 계량인자로는 초음파 조사세기, 주정/초순수 부피 비, 초음파 조사시간으로 설정하였다. 이로부터 Box-Behnken 설계모 델이 제시하는 15개의 조건에 대해서 실험을 진행하여 각 계량인자에 대한 수율의 2차 회귀방정식을 식 (4)에 나타내었다.

여기서 Y는 수율이고, X₁은 초음파 조사세기, X₂는 주정/초순수 부 피비, X₃은 초음파 조사시간이다. 이로부터 계산된 각 계량인자에 대 한 수율의 변화를 나타내는 3차원 그래프와 등고선도를 Figure 6에 나 타내었다. 주효과도를 나타내는 식 (4)에서 일차항의 계수는 X₃(4.6), X₂(0.29), X₁(0.2446) 순으로 크게 나타났으며, 그래프의 기울기와 등 고선의 조밀도는 초음파 조사시간, 주정/초순수 부피비, 초음파 조사 세기 순으로 크게 나타났다. 이때 초음파 조사시간의 p-value가 0.02, f-value가 6.27로 산출되었다. 따라서 초음파 추출법에서는 초음파 조 사시간, 주정/초순수 부피비, 초음파 조사세기 순으로 주효과도가 큰 것을 알 수 있었다. 교호효과도를 나타내는 계량인자는 X₁X₂, X₁X₃, X₂X₃이며, X₂X₃(0.01073), X₁X₃(0.00146), X₁X₂(0.00038) 순으로 계 수가 크게 나타나 (주정/초순수 부피비 × 초음파 조사시간), (초음파 조사세기 × 초음파 조사시간), (초음파 조사세기 × 주정/초순수 부피 비) 순으로 교호효과가 큰 것을 알 수 있었다. 이때 (주정/초순수 부피 비×초음파 조사시간)의 p-value가 0.059, f-value가 5.94로 산출되었다.

초음파 추출법의 플라보노이드 함량 최적화의 계량인자는 초음파 조 사세기, 주정/초순수 부피비, 초음파 조사시간으로 설정하였다. 식 (5) 는 항산화성분인 플라보노이드 함량과 각 계량인자의 관계를 나타낸 2차 회귀방정식이다.

여기서 F는 플라보노이드 함량이고, X₁은 초음파 조사세기, X₂는 주정/초순수 부피비, X₃은 초음파 조사시간이다. Figure 7은 회귀방정 식에서 하나의 계량인자를 고정시킴으로 플라보노이드 함량과 두 개 의 계측인자의 관계를 보여준다. 일차항은 X₁, X₂, X₃이고, 일차항의 계수의 크기는 X₃(2.47), X₁(0.0291), X₂(0.026) 순으로 크다. 그리고 그래프의 기울기와 등고선의 조밀도는 초음파 조사시간, 초음파 조사 세기, 주정/초순수 부피비 순으로 크다. 또한 p-value가 0.009, f-value 가 17.37로 가장 큰 초음파 조사시간이 수율에 가장 중요한 주효효과 도이다. 따라서 초음파 추출법에서는 초음파 조사시간, 초음파 조사세 기, 주정/초순수 부피비순으로 주효과도가 큰 것을 알 수 있었다. 식 (5)에서 교호효과도를 나타내는 X₁X₃(0.00358), X₂X₃(0.00293), X₁X₂ (0.00029) 순으로 크게 나타났으며, 그래프는 (초음파 조사세기 × 주정/초 순수 부피비), (주정/초순수 부피비 × 초음파 조사시간), (초음파 조사세 기 × 초음파 조사시간) 순으로 교호효과가 큰 것을 알 수 있었다. 이 때 (초음파 조사세기 × 초음파 조사시간)의 p-value가 0.091, f-value가 4.37이었다.

Figure 8은 반응치를 95% 신뢰구간과 실험값을 보여주는 확률도이 다. 그래프의 점들이 실제실험의 반응치를 나타내며, 곡선은 신뢰구간 을 나타낸다. 확률도의 왼쪽부터 낮은 반응치, 중간 반응치, 높은 반응 치를 나타낸다. 모든 점들이 선분들 안에 둘러싸여 있는 조밀한 형태 를 보이므로 신뢰도는 95% 이상으로 실험의 타당성을 보여준다.

Figure 9는 초음파 추출법을 통해 추출된 항산화성분의 수율 및 플 라보노이드 함량의 최적화 그래프이다. 계량인자는 초음파 조사세기, 주정/초순수 부피비, 초음파 조사시간이다. 모든 계량인자가 증가할 때, 반응치는 증가하다가 감소한다. 그래프의 기울기를 보면 초음파 조사시간의 영향이 가장 크고, 초음파 조사세기와 주정/초순수 부피비 의 영향은 비슷한 수준인 것을 알 수 있었다. 그래프에서 빨간색의 세 로선이 추출의 최적의 조건을 나타내며, 파란색의 가로선이 최적조건 일 때 최적화된 반응치를 뜻한다. 수율과 플라보노이드 함량의 최적 화를 나타내는 계량인자는 초음파 조사세기 512.63 W, 주정/초순수 부 피비 56.97 vol.%, 추출시간 20.79 min이다. 이때, 수율은 21.16 wt.%, 플라보노이드 함량은 28.96 mg QE/mL dw으로 나타났다. 반응표면분 석법을 통한 최적화된 조건에서 여러 번의 실험을 진행한 결과 오차 범위는 3% 미만으로 Box-Behnken 설계모델의 신뢰도가 상당히 높다 는 것을 확인하였다.

4. 결 론

본 연구에서는 민들레에 함유되어있는 항산화성분의 추출을 위해 두 가지 추출방법(열수추출법, 초음파추출법)을 사용하였다. 그리고 추 출의 최적화를 위해 반응표면법의 Box-Behnken 설계모델을 사용하였 다. 그리고 이를 분석하여 다음과 같은 결과를 얻어내었다.