1. 서 론
고령화 사회로의 진입이 가속화되면서 건강 및 노화방지에 대한 다 양한 연구가 진행되고 있다. 노화와 질병의 원인으로 알려진 활성산 소종(reactive oxygenspecies, ROS)은 대사활동에 의해 유입되고, 체내 에 축적되어 세포손상을 일으켜 노화나 질병을 유발시킨다[1-3]. 따라 서 노화 방지와 질병의 예방을 위해서는 항산화시스템의 균형을 유지 하는 것이 중요하며, 이를 위해 충분한 양의 항산화 물질을 섭취해야 한다. 피부 관리 영역에도 마찬가지다. 피부 세포 노화 따라 다중 피 부 질병을 방치 위해 항산화 기능성 가진 화장품을 더욱 발달하게 개 발해야 된다고 생각하다. 항산화 물질로 알려진 금은화(Lonicera japonica) 는 인동과 인동덩굴과 같은 덩굴식물의 꽃으로 처음 피었을 때 흰색이었다가 시간 지남에 따라 금색으로 바뀌어 붙여진 이름이다. 금은화는 강한 환경적응성을 가지고 있어 산성 및 알칼리성 토양 모 두에 생존할 수 있으며, 해열 및 해독효과가 있는 것으로 알려져 있다. 금은화에는 chlorogenic acid와 cinaroside 등이 함유되어 있어 용혈성 연쇄상 구균 및 포도상 구균 등 다종 병원균 및 기관지 감염을 야기한 병독 등에게 강한 억제력을 가지고 있다. 또한 면역력을 증강시켜 간 을 보호하고 항암, 소염, 해열, 지혈 등의 효능을 가지고 있다[4-7]. 회 화꽃망울(Flos Sophorae Immaturus)은 회화나무(Sophora japonica L.) 의 꽃망울이며, 소염, 항균, 피부노화 예방 등에 효용이 있는 것으로 알려져 있었다[8-10]. 금은화과 마찬가지로 회화나무도 강한 생명력으 로 중국에 광범하게 생장하고 있으며, 예로부터 약차로 음용하여 해 열, 해독 등의 효능을 가지고 있다.
따라서 본 연구에서는 금은화와 회화나무꽃으로부터 항산화성분을 추출하는 용매추출공정의 최적화를 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하였다. 반응표면분석법의 반응치 (response)로는 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 설정하였고, 독 립변수로는 추출시간, 주정/초순수 부피비, 추출온도 등을 설정하였 다. 이를 바탕으로 중심합성계획모델로부터 산출된 회귀방정식을 이 용하여 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 동시에 최적화시킴으로 써 최적 추출조건을 제시하고자 하였다.
2. 실험방법
2.1. 천연물로부터 항산화성분의 추출
추출 본 연구에서는 건조 분쇄된 금은화와 회화나무꽃으로부터 항산화 성분을 추출하기 위해 추출용매로 초순수(Vivagenen EXL-III)와 95%- 주정(Daehan Ethanol Life Co.)을 이용하였다. 추출용매 500 mL를 기 준으로 금은화 시료의 양을 20 g으로 고정하여 실험을 수행하였으며, 반응표면분석법의 독립변수를 결정하기 위해 기초실험 범위로는 추출 시간(1~4 h), 주정/초순수 부피비(20~80 vol.%), 추출온도(40~70 ℃) 등을 설정하였다. 금은화로부터 추출된 항산화성분의 추출수율은 원 료 20 g을 기준으로 냉동건조법(freeze drying method)을 이용하여 얻 은 항산화성분의 질량을 측정하여 계산하였다. 냉동건조법은 금은화 로부터 추출된 항산화성분을 고형화하는 과정으로 추출액을 여과한 후 진공회전증발기(Eyela N-N type, Aspirator A-3S)를 이용하여 농축 하였다. 농축된 추출액을 1차로 -10 ℃에서 6 h 동안 동결한 후 냉동 건조장치(LP3, Jouan, France)에서 0.1 mbar, -40 ℃의 조건으로 24 h 냉각건조하였다.
2.2. DPPH 라디칼소거활성 분석
천연물로부터 추출된 항산화성분의 항산화 분석을 위해 자외선 분 광분석기(Optizen 2120 UV, MECASYS)를 이용하여 DPPH 라디칼소 거활성를 측정하였다. DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 측정은 Lu와 Foo 등이 제안한 방법으로 진행하였다[13]. 0.2 mL의 시료 용액 에 0.1 mL의 DPPH (15 mg/100 mL methanol) 용액을 가하여 10 min 간 암실에서 반응시킨 후 자외선 분광분석기의 파장을 517 nm로 조 절하여 흡광도를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않은 무첨가군 (control)과 비교하여 다음과 같이 DPPH 라디칼소거활성을 백분율(%) 로 나타내었다[11,12].
3. 결과 및 고찰
3.1. 반응표면분석법의 독립변수범위 설정
금은화와 회화나무꽃으로부터 항산화성분을 추출하기 위한 추출공 정의 독립변수 범위를 설정하기 위해 기초실험을 진행하였다. 기초실 험은 추출시간(1~4 h), 주정/초순수 부피비(20~80 vol.%), 추출온도 (40~70 ℃) 등에서 진행하였으며, 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 통해 반응표면분석법에 적용할 독립변수범위를 설정하였다. Figure 1은 각 독립변수에 따른 금은화와 회화나무꽃으로부터 추출된 항산화성 분의 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 나타낸 그림이다. 추출시간 이 증가함에 따라 추출수율은 증가하는 경향을 나타내었으나 3 h 이 상에서는 추출량의 변화가 거의 나타나지 않았다. 또한 추출시간이 증가하면 DPPH 라디칼소거활성은 증가하다 감소하는 경향을 나타내 었다. 이는 추출과정 중 추출시간이 증가함에 따라 추출량은 증가하 나 추출물의 DPPH 라디칼소거활성은 거의 일정하게 추출됨으로써 추출수율은 증가하나 추출물 중 DPPH 라디칼소거활성은 감소하기 때문으로 사료된다. 주정/초순수 부피비에 따른 금은화 중 유효성분의 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 측정한 결과 주정/초순수 부피 비가 증가함에 따라 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성 모두 증가하 다 감소하는 경향을 나타내었다. 추출온도 변화에 따른 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성의 변화 역시 추출시간과 마찬가지로 추출수율 은 추출온도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 나타내었으나 DPPH 라디칼소거활성은 증가하다 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 추출 온도가 증가하면 추출량은 증가하나 금은화 중 추출되는 DPPH 라디 칼소거활성은 거의 일정하게 추출되기 때문으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 모두 고려하여 반응 표면분석법에 적용할 독립변수 범위를 금은화의 경우 추출시간(1.5~2.5 h), 주정/초순수 부피비(30~50 vol.%), 추출온도(50~60 ℃)로 회화나 무꽃의 경우 추출시간(1.5~2.5 h), 주정/초순수 부피비(50~70 vol.%), 추출온도(45~55 ℃)로 설정하였다.
3.2. 금은화로부터 항산화물질의 추출특성
본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 금은화의 열수추출공정 의 추출조건을 최적화하였다. 반응표면분석법은 통계학적인 특성과 수학적 기술을 결합하여 여러 조건에 따른 최적화된 공정을 제시한다 [13]. 추출공정에 중요한 독립변수로 고려되는 인자에 대한 실험범위 는 추출시간(1.5~2.5 h), 주정/초순수의 부피비(30~50 vol.%), 추출온 도(50~60 ℃)를 사용하였다. 독립변수에 영향을 받는 반응치는 유효 성분의 추출수율과 DPPH 라디칼소거활성을 측정하여 그 값을 회귀 분석에 사용하였다. 추출공정의 최적 조건을 찾기 위해 중심합성계획 법에 따라 설계된 Table 1과 같이 20개의 조건에 대하여 각 실험을 진행하였다. Table 1의 독립변수에서 실험을 진행한 후 각각의 결과를 반응표면분석법으로 최적화하여 독립변수에 따른 추출수율과 항산화 물질 성분 함량에 대한 회귀방정식을 얻었다. 중심합성계획법에 따라 설계된 추출공정의 추출수율에 대한 반응표면분석 회귀방정식은 다 음과 같다.
여기서 Y는 반응표면분석법에서 반응치로 설정한 유효성분의 추출 수율이고, 독립변수인 x1, x2, x3는 각각 추출시간, 주정/초순수의 부피 비, 추출온도이다. Figure 2는 식 (2)의 회귀방정식을 활용하여 추출수 율에 따른 인자에 대한 영향을 각각 3차원 표면그래프와 등고선도로 나타낸 그림이다. 여기 세 가지 계량인자 안에 두 개의 수율에 영향을 나타내기 위해 하나 고정 인자 값이 각각 추출시간 2.04 h, 주정/초순 수 부피비 41.87 vol.%, 추출온도 55.25 ℃로 하였다. 따라서 주효과도 인 (추출시간) : (주정/초순수의 부피비) : (추출온도)의 비율은 7.28 : 1.0 : 5.63로 나타내며, 교호효과도인 (추출시간 × 주정/초순수의 부피 비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출온도)의 비율은 27.73 : -18.26 : 1.0로 나타났다.
반응표면분석법 중 중심합성계획법에 따라 설계된 열수추출공정의 DPPH 라디칼소거활성에 대한 반응표면분석 회귀방정식은 다음과 같다.
여기서 AO는 DPPH 라디칼소거활성이고 독립변수인 x1, x2, x3는 순서대로 추출시간, 주정/초순수의 부피비, 추출온도로 설정하였다. Figure 3는 위에 회귀방정식을 이용하여 계산된 독립변수에 따른 추 출 된 유효성분의 DPPH 라디칼소거활성을 3차원 그래프와 등고선도 그림이다. 이 회귀방정식에 따라서 DPPH 라디칼소거활성에 대해 인 자들 미친 영향의 강도비율은 추출시간 : 주정/초순수의 부피비 : 추출 온도의 비율은 13.34 : 1.0 : 5.22로 나타내며, 서로 미친 영향의 교호 효과도인 (추출시간 × 주정/초순수의 부피비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출온도)의 비율은 45.49 : -64.51 : 1.0로 나타났다.
본 연구에서 각 독립변수의 주효과도와 교호효과도를 정확하게 보 이기 위해 각 독립변수의 변화에 따른 추출수율 및 DPPH 라디칼소거 활성의 변화를 Figure 4에 나타내었다. 본 연구에서 산출된 최적조건 인 추출시간(2.08 h), 주정/초순수의 부피비(41.53 vol.%), 추출온도 (55.08 ℃)를 기준으로 기초실험으로 하였다. 동일한 변화 범위를 유 치하기 위해 선정된 각 독립변수 범위의 고정 폭 10%를 증가 또는 감 소시켜 회귀방정식으로부터 계산하였다. 구제적인 설정된 범위는 최 적추출시간 2.08 h을 기준으로 ± 0.1 h, 주정/초순수의 부피비의 최적 조건인 41.53 vol.%을 기준으로 ± 2.0 vol.%, 최적추출온도인 55.08 ℃를 기준으로 ± 1.0 ℃를 각 조건의 ± 10%로 설정하였으며, 모든 독 립변수의 경우 최적조건을 기준으로 증가하다 감소하는 경향을 나타 내었다. 그림에서와 같이 주정/초순수의 부피비가 추출수율 및 DPPH 라디칼소거활성에 대해 가장 큰 영향을 미치며, 나머진 두 개 독립변 수인 추출온도와 추출시간부터 실험 결과에 미친 영향이 그 뒤를 따 르는 것을 알 수 있었다.
3.3. 회화나무꽃으로부터 항산화물질의 추출
회화나무꽃으로부터 항산화물질의 추출공정은 금은화 추출과 비슷 하게 기출 실험에 대해 분석해서 표면분석법을 이용한 독립변수 범위 를 설정하였다. 금은화 추출공정에 나온 데이터와 비교하기 위해 기초 실험조건은 추출시간(1.5~2.5 h), 주정/초순수의 부피비(50~70 vol.%), 추출온도(45~55 ℃)로 설정하였다.
추출공정의 최적 조건을 찾기 위해 금은화 추출공정과 비슷하게 중 심합성계획법에 따라 설계된 20개의 조건이 Table 2에 정리하였다. 각 조건에 대하여 실험을 진행하며, 받은 실험 데이터를 반응표면분석법 으로 최적화하여 독립변수에 따른 추출수율과 항산화물질 성분 함량 에 대한 다음과 같은 회귀방정식을 얻었다.
Figure 5는 위의 회귀방정식을 활용하여 추출수율에 따른 인자에 대 한 영향을 각각 3차원 표면그래프와 등고선도로 나타난 그림이다. 주 효과도인 (추출시간) : (주정/초순수의 부피비) : (추출온도)의 비율은 5.74 : 1.0 : 3.28로 나타났으며, 교호효과도인 (추출시간 × 주정/초순 수의 부피비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출 온도)의 비율은 -8.57 : -62.86 : 1.0로 나타났다. 따라서 한 가지 인자 를 최적값으로 고정하면 나머진 두 인자에 따른 유효성분의 추출수율 은 각 인자별로 다른 경향을 보였다. 하나씩 고정 인자 값이 각각 추 출시간(2.13 h), 주정/초순수의 부피비(62.89 vol.%), 추출온도(50.42 ℃)로 산출되었다.
같은 반응표면분석법 중 중심합성계획법원리로 설계된 열수추출공 정의 항산화성분 함량에 대한 반응표면분석 회귀방정식은 다음과 같다.
이 회귀방정식을 이용하여 DPPH 라디칼소거활성에 따른 인자에 대한 영향을 Figure 6에 3차원 그래프와 등고선도로 나타내었다. 주효 과도인 (추출시간) : (주정/초순수의 부피비) : (추출온도)의 비율은 11.16 : 1.0 : 5.36로 나타내며, 교호효과도인 (추출시간 × 주정/초순수 의 부피비) : (추출시간 × 추출온도) : (주정/초순수의 부피비 × 추출온 도)의 비율은 77.50 : -157.69 : 1.0로 나타났다.
각 독립변수들의 주효과도와 교호효과도를 확인하기 위해 섭동 (perturbation) 그래프를 이용하여 해석하였다. 금은화 추출공정과 마 찬가지로 본 연구대상 회화나무꽃으로부터 최적 추출조건인 추출시 간(2.13 h), 주정/초순수의 부피비(62.89 vol.%), 추출온도(50.42 ℃)를 기준으로 각 독립변수 범위의 10%를 증가 또는 감소시켜 회귀방정식 으로 계산하였다. 즉, 추출시간 2.13 h 기준으로 ± 0.1 h, 주정/초순수 의 부피비 경우 62.89 vol.%을 기준으로 ± 2.0 vol.%, 추출온도 경우 50.42 ℃를 기준으로 ± 1.0 ℃를 설정하여 Figure 7에 나타내었다. 그림 에서와 같이 세 가지 독립변수 중 주정/초순수의 부피비가 실험결과에 대하여 제일 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
3.4. 종합만족도 평가
Figure 8은 금은화 추출공정 실험 결과 통해 추출수율과 DPPH 라 디칼소거활성 두 반응치를 함께 고려한 최적한 추출조건인 추출시간 = 2.08 h, 주정/초순수 부피비 = 41.53 vol.%, 추출온도 = 55.08 ℃에 따른 최적화 종합만족도 그래프이다. 이 조건으로부터 예상되는 반응 값이 각각 추출수율 = 37.38 wt.%, DPPH 라디칼소거활성 = 40.37% 로 나타났다. 또한 Figure 9는 회화나무꽃 추출공정 결과 통해 금은화 추출공정과 동일한 방법으로 두 반응치를 함께 고려해서 만든 최적화 종합만족도 그래프이다. 여기 3가지 변수의 최적 조건은 각각 추출시 간 = 2.13 h, 주정/초순수 부피비 = 62.89 vol.%, 추출온도 = 50.42 ℃ 이다. 최적 조건에 예상하게 얻을 수 있는 반응치가 각각 추출수율 = 35.43 wt.%, DPPH 라디칼소거활성 = 55.27%로 나타났다.
4. 결 론
본 연구에서는 열수 추출공정을 이용하여 금은화 및 회화나무꽃으 로부터 유효성분을 추출하고, 중심합성계획모델을 이용하여 추출수율 과 DPPH 라디칼소거활성을 최적화한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
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금은화로부터 추출공정 경우 모든 독립변수에 대해 최적조건을 기준으로 증가하다 감소하는 경향을 나타내었으며, 주정/초순수의 부 피비는 추출수율 및 DPPH 라디칼소거활성에 대해 제일 큰 영향을 미 친 것을 알 수 있다. 중심합성계획모델로 최적화과정을 수행한 결과 추출시간(2.08 h), 주정/초순수의 부피비(41.53 vol.%), 추출온도(55.08 ℃)에서 개별 최대값인 수율(37.38 wt.%), DPPH 라디칼소거활성 (40.37%) 값을 나타내었다.
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회화나무꽃으로 추출공정 경우 3가지 독립변수에 대해 증가하는 경향을 나타내었으나 최적조건 이후 증가율이 감소하였다. 따라서 회 화나무꽃으로부터 항산화 유효성분을 추출하는 추출공정에 추출수율 및 DPPH 라디칼소거활성에 대해 가장 큰 영향을 미친 변수인 주정/ 초순수의 부피비가 가장 중요한 독립변수인 것을 알 수 있었다. 중심 합성계획모델로 최적화과정을 수행한 결과 추출시간(2.13 h), 주정/초 순수의 부피비(62.89 vol.%), 추출온도(50.42 ℃)에서 개별 최대값인 수율(35.43 wt.%), DPPH 라디칼소거활성(55.27%) 값을 나타내었다.
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두 추출공정에서 금은화 및 회화나무꽃의 추출물은 모두 효과적 인 항산화능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 추출수율의 경우 금은화가 회화나무꽃에 비해 조금 높은 값을 나타내었으나 DPPH 라 디칼소거활성의 경우 회화나무꽃에서 추출한 항산화물질이 금은화에 비해 높은 값을 나타내었다.