1. 서 론
사람의 피부는 자외선이나 유해 화학물질과 같은 외부의 자극물질 들이 신체 내부로 들어올 수 없도록 보호하는 역할을 한다. 반면, 피 부 표면은 수많은 미세주름으로 이루어져 있고 피부 위에 다양한 유 기물들이 미세하게 축적됨에 따라 그 안에서 미생물들이 증식할 수 있는 환경을 제공해 준다[1]. 다양한 피부 미생물 중에서도 아토피 피 부염을 유발하는 Staphylococcus aureus[2,3], 여드름 염증을 유발하는 Propionibacterium acnes[4] 등 피부에 유해한 균들이 지속적으로 보 고되고 있으며, 학문 및 산업 분야 전반에 걸쳐 피부 상재균에 대한 다양한 항균 소재들이 개발되어 일상생활에까지 기능성 화장품 등으 로 상용화되어 있다.
현재 화장품 소재 분야에서는 피부 표면의 유해균의 증식을 막고 및 기타 세균들에 의한 화장품의 변질을 방지하기 위해 다양한 항균 제가 사용된다[5-8]. 산업 분야에서 주로 사용되는 항균 소재는 액상 으로 이루어진 유기 항균제가 대부분이며, 그 외에는 은 나노입자와 같은 무기 항균제가 사용된다. 하지만 현재 상용화된 대부분의 항균 제는 독성을 가지고 있어 피부 알레르기와 같은 부작용을 일으킬 뿐 만 아니라 섭취나 흡입 시 복통, 구토 등의 부작용도 있어 점차 사용 량을 제한하는 추세이다. 이러한 수많은 문제점들로 인해 최근에는 인체에 해가 없는 천연 성분들을 이용한 항균제의 개발이 대두되고 있 다. 최근에는 솔잎[9], 녹차[10], 강황[11], 황련[12], 프로폴리스[13] 등 과 같은 천연물을 추출하여 항균제로 사용하는 연구가 활발히 진행되 고 있으나, 보고된 천연유래 항균제의 경우 특유의 냄새와 색, 제형상 의 문제점, 낮은 수율 및 열과 환경에 의한 불안정성 등으로 인해 상 용화되기에는 어려움이 많다. 이러한 단점들을 보완하기 위해 항균 물 질들을 나노 크기의 전달체에 담아 입자화하는 연구가 활발하게 수행 되고 있다. 항균 활성의 보호와 저장 안정성 효율을 높이기 위해 나노 캡슐화(nanoencapsulation)하는 방법이 가장 일반적이며, 물리적인 외피 를 제공함으로써 외부환경으로부터 생리적 활성을 보호할 수 있다[14].
소나무(Pinus densiflora)는 소나무과(Pinacesae)에 속하는 상록성 침 엽수로 한국, 일본 중국 및 러시아 전역에 분포하며 한반도 전체 수목 의 1/3을 차지하고 있는 대표적인 수종이다. 특히 솔잎은 camphene, α-pinene, β-pinene과 같은 정유(essential oil) 성분과 quercetin, kaempferol과 같은 플라보노이드(flavonoid) 성분이 다량 함유되어 있 으며[15-17], 이러한 성분들은 다양한 방법으로 추출되어 소재화된다. 솔잎 추출물의 항균 효과에 대해서는 광범위하게 연구되고 있으며 [9,16], 그 외에도 항산화, 항염 등의 효과가 우수하고 피부에 자극이 없는 천연 소재로 밝혀져 있다[17-19].
최근, 유/무기 복합 소재는 매우 간단하고 편리하게 합성할 수 있을 뿐만 아니라, 다기능성을 부여하기에 적합하여 많은 연구자들에게 흥 미를 불러일으키고 있다. 특히, 금속 수산화물(metal hydroxide)은 다 양한 기능을 하는 첨가제로서 많은 연구가 이루어지고 있고, 그중에 서도 Mg, Cu, Ni, Fe, Co 등의 금속 이온을 함유하는 이중 층상 수산 화물(layered double hydroxide)은 표면 작용기를 원하는 대로 조절할 수 있으며 특유의 넓은 표면적으로 인해 화합물 전달체[20], 전기 화 학적 촉매[21], 유해물질 흡착제[22] 등의 연구에 있어 많은 관심을 받 고 있으며, 인체에 대해 독성이 없어[23] 최근 화장품 소재 및 생체재 료로 활발하게 연구가 진행되고 있다. 특히 화합물 전달체 연구의 경 우, 층과 층 사이에 DNA[24], 단백질[25] 또는 약물[26] 등을 탑재할 수 있으며, 탑재하는 화합물의 성질에 따라 표면 작용기를 선택하여 조절할 수도 있다[27]. 하지만 이전 연구들의 경우 약물의 탑재를 위 해서는 층과 층간의 박리 또는 팽윤 단계가 필요하다. 층간의 반 데르 발스 인력이 강하게 작용하고 경우에 따라서는 수소결합 또한 이루어 져 있어, 이를 극복하고 약물을 탑재하기 위해서는 용매 내에 장시간 팽윤시켜 탑재하거나[28], 계면활성제를 사용한 층상 구조물의 박리 가 필수적이다[29].
본 연구에서는 천연 항균 소재인 솔잎 추출물이 마그네슘-층상규산 염 층간에 삽입된 샌드위치 구조의 나노 항균 소재를 합성하였다. 합 성된 물질은 층간의 박리 또는 팽윤 단계 없이 한 단계로 합성되어 제조 공정을 단축시켰으며 피부염을 일으키는 피부 상재균에 대해 항 균 활성을 보여, 화장품, 생체재료 및 플라스틱 소재 등에 항균 첨가 제로서 다양한 응용이 가능할 것으로 보인다.
2. 실 험
2.1. 실험 재료
마그네슘-층상규산염을 합성하기 위한 magnesium chloride hexahydrate (MgCl2⋅6H2O)는 Duksan Pure Chemicals (Korea)의 시약을 사 용하였으며, (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)는 Sigma-Aldrich (USA)의 제품을 구매하여 추가의 정제 과정 없이 사용하였다. 에탄올은 솔잎의 추출, 마그네슘-층상규산염의 합성 및 세척 용매로서 Duksan Pure Chemicals사의 제품을 사용하였다.
2.2. 솔잎의 추출 및 수율
마그네슘-층상규산염의 층간 사이로 삽입할 솔잎 추출물(PLE)은 다음과 같은 방법으로 추출되었다. 건조된 솔잎 200 g을 95% 에탄올 2.0 L에 넣어 60 ℃에서 3 h 동안 100 rpm으로 진탕하여 추출하였다. 솔잎 에탄올추출액은 여과 후 여액을 동결건조하여 솔잎 추출물 파우 더를 얻었다. 수율은 솔잎 건조 중량인 200 g을 기준으로 계산되었으 며, 솔잎 추출물의 수율은 11.0%이었다.
2.3. 솔잎 추출물이 삽입된 마그네슘-층상규산염(PLE/MgP)의 합성
Table 1에서 보여준 것처럼 솔잎 추출물이 삽입된 마그네슘-층상규 산염(PLE/MgP)을 합성하기 위해서 에탄올 100 mL에 MgCl2⋅6H2O 6.10 g (30 mmol)과 동결건조한 솔잎 추출물(PLE)을 각각 0.075, 0.150, 0.300 g을 녹인 후, APTES 8.84 g (40 mmol)을 넣고 12 h 동안 상온 에서 100 rpm으로 교반하여 합성하였다. 합성한 PLE/MgP는 원심분 리와 에탄올을 사용하여 세척을 3회 반복한 후, 동결건조하여 수득하 였다. 솔잎 추출물이 삽입되지 않은 마그네슘-층상규산염(MgP)은 솔 잎 추출물을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 합성 및 수득하였다.
2.4. 분석
합성된 PLE/MgP 샌드위치 나노입자에서 마그네슘-층상규산염의 결 정 구조를 분석하기 위해서 X-ray diffractometer (XRD, X’Pert3 Powder, PANalytical)를 사용하였고, nickel-filtered Cu Kα (λ = 0.154 nm) 광 원을 사용하여 0~70°/2 theta의 주사 범위를 4.0°/min의 스캔 속도로 분석하였다. 또한 층간거리를 더욱 명확하게 확인하기 위해 4~8°/2 theta의 주사 범위를 0.4°/min의 스캔 속도로 분석하였다. 시료 내 작 용기 분석을 위해 Fourier-transform infrared spectrometer (FT-IR, Nicolet iS10, Thermo)를 사용하여 800~4,000 cm-1의 범위를 32번의 스캔(resolution = 4 cm-1)을 통해 분석하였다. PLE/MgP 내에 솔잎 추 출물의 함량을 확인하기 위해 thermogravimetric analysis (TGA, Q50, TA Instrument)를 사용하여 승온속도 10 ℃/min으로 25 ℃부터 800 ℃ 까지 대기 조건하에서 분석하였다. 합성한 PLE/MgP의 모폴로지를 확 인하기 위해 high-resolution transmission electron microscope (HR-TEM, Tecnai F20 UT)을 사용하여 입자의 크기 및 입자 내부의 intercalant를 확인하였다. 합성한 PLE/MgP 샌드위치 나노입자의 항균 활성을 분석 하기 위해 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 및 최소사멸농도(minimum bactericidal concentration, MBC)를 측정하였 다. 대장균(Escherichia coli, KCTC 2571), 포도상구균(Staphylococcus aureus, KCTC 3881) 및 여드름균(Propionibacterium acnes, KCTC) 세 가지 균주를 시험균주로 선택해서 각각의 배지에 접종해 16 h 동안 37 ℃의 미생물 배양기에서 150 rpm으로 진탕 배양 후 OD660에서 흡 광도를 측정하여 1 × 106 CFU/mL이 되도록 희석을 하였다. 시료 농도 는 2,000, 1,500, 1,000, 500, 250, 125 ppm의 농도가 되도록 균배양액 에 처리하였으며 16 h 동안 37 ℃의 미생물 배양기에서 150 rpm으로 진탕 배양한 후 고체배지에 도말하여 MIC 및 MBC 시험을 하였다.
3. 결과 및 고찰
본 연구에서는 솔잎 추출물이 삽입된 마그네슘-층상규산염 샌드위 치 구조의 나노입자를 합성하였으며 합성된 물질의 화학적 구조를 XRD 분석을 통해 확인하였다. Figure 1은 one-pot silylation으로 솔잎 추출물이 삽입된 샌드위치 나노입자 각각의 XRD 구조 분석 스펙트럼 이다. Figure 1(A)는 솔잎 추출물을 사용하지 않고 one-pot으로 합성한 MgP 나노입자의 XRD 패턴이다. 각각 6.00, 10.07, 22.50, 34.47, 58.97° 에서 팔면체와 사면체 구조를 가진 마그네슘-층상규산염의 참조 피크 인 d001, d003, d020,110, d130,200 그리고 d060,330 부분이 동일한 것을 확인하 였다[30]. Figure 1(B), (C) 그리고 (D)는 솔잎 추출물이 삽입된 MgP 나노입자의 화학적 구조를 분석한 데이터이다. 층간거리(d-spacing)를 나타내는 d001을 제외하고는 합성 이후에도 화학적 구조가 변하지 않 고 동일한 구조의 화합물이라는 것을 참조 피크들을 통해 확인하였다. 층간거리를 좀 더 명확하게 비교 확인하기 위해 Figure 1의 오른쪽 위 에 나타내었듯이 4~8°/2 theta의 주사 범위로 세밀하게 분석하였다. 분석 결과 MgP 나노입자의 경우 5.997°, PLE/MgP-1은 5.764°, PLE/MgP-2는 5.513° 그리고 PLE/MgP-3는 5.463°로 확인되었다. 솔 잎 추출물이 삽입된 마그네슘-층상규산염의 샌드위치 구조 및 층간거 리에 대한 모식도는 Figure 2에 나타내었으며, Table 2에 브래그 법칙 을 적용해 층간거리(d-spacing)를 계산한 결과를 나타내었다. MgP의 경우 1.474 nm로 상대적으로 짧은 층간거리를 나타내었으나, 합성 시 사용되는 솔잎 추출물의 비율이 증가함에 따라 층간거리 또한 증가하 는 경향을 보였고, PLE/MgP-3의 경우 1.616 nm로 상대적으로 긴 층 간거리를 가지는 것으로 확인하였다. XRD를 통한 구조 분석 결과를 통해 솔잎 추출물이 마그네슘-층상규산염의 합성 과정 동안 구조 형 성에 방해를 하지 않으며, 이와 동시에 층간에 삽입되었다는 것을 확 인하였다.
Figure 3(A), (B)는 합성된 MgP 나노입자 및 솔잎 추출물이 삽입된 PLE/MgP 샌드위치 나노입자의 HR-TEM 이미지이다. MgP의 경우 여 러 층이 조밀하게 겹겹이 쌓여 있으며 대략 100 nm 전후의 입자크기 를 가지는 것을 확인하였다. 솔잎 추출물이 삽입된 PLE/MgP 샌드위 치 나노입자의 경우에도 여러 층이 겹겹이 쌓여 있으며 입자의 크기 는 약 100 nm로 MgP와 유사한 것으로 보아 합성 시에 솔잎 추출물이 MgP의 구조 형성 및 입자 크기에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주고 있다. 하지만 PLE/MgP의 경우 솔잎 추출물이 층간에 삽입 된 내부 모폴로지를 명확하게 비교하여 확인할 수 있으며 상대적으로 거친 모폴로지를 보여주었다. Figure 3(C), (D)는 MgP 및 PLE/MgP 의 HR-SEM 이미지이다. HR-TEM과 비교하였을 때 명확하게 모폴로 지를 확인할 수 없으나, 균일한 입자 분포를 확인할 수 있다. Figure 3(E)는 PLE/MgP의 EDX 스펙트럼으로 Figure 2의 화학 구조 모식도 와 동일한 원소를 가지고 있으며, 표면에 형성된 amine기(-NH2)를 포 함해 PLE/MgP 샌드위치 나노입자가 성공적으로 합성되었음을 확인 하였다.
MgP는 MgCl2⋅6H2O 및 APTES의 silylation 반응을 통하여 합성하 였고, 층상 구조의 형성과 동시에 층과 층 사이에 솔잎 추출물이 삽입 되어 샌드위치 구조의 PLE/MgP 나노입자를 제조하였다. MgP 표면에 형성된 amine기(-NH2)를 확인하기 위해 FT-IR 분광법을 이용하였다. Figure 4에서 보여준 것처럼, MgP의 스펙트럼에서는 Figure 2의 화학 적 구조 모식도와 같이 MgP 골격의 Si-C stretch (1,110 cm-1), Si-O-Si bend (1,015 cm-1) 및 O-H stretch (3,300~3,450 cm-1)를 확인하였으며, MgP 표면의 propylamine moiety의 존재를 확인할 수 있는 C-H stretch (2,950~3,100 cm-1) 및 N-H stretch (3,700 cm-1)를 확인하였다. PLE의 경우에는 다양한 화합물이 혼합되어 있어, 모든 화학 작용기를 일일 이 구분하는 것은 매우 어려우나, 3,200~3650 cm-1에 넓게 걸쳐있는 -OH 관련 peak와 1,630~1,750 cm-1에서 C=O stretch를 확인할 수 있 었다. PLE/MgP의 경우, 삽입된 PLE에 의해 MgP의 고유한 N-H, Si-C, Si-O-Si peak의 강도가 상대적으로 감소하는 경향을 보였으며, 특히 PLE의 비율이 증가함에 따라 C=O stretch peak 또한 1,630~1,750 cm-1에서 증가함을 보였다. FT-IR 분광법을 통한 이러한 결과들을 종 합하면 MgP가 모식도대로 성공적으로 합성되었으며 그 표면에는 amine기를 함유하고 있는 것으로 확인되며, 천연 항균제인 솔잎 추출 물 또한 MgP에 성공적으로 함유되었다는 결과를 예상할 수 있다.
합성된 PLE/MgP 내에 PLE와 MgP의 무게 비율을 확인하기 위해 열 중량 분석법을 이용하여 분석하였다(Figure 5). 합성 후 동결건조를 통 해 최종 수득된 MgP, PLE/MgP-1, PLE/MgP-2, PLE/MgP-3 및 PLE 시 료들을 각각 10 mg씩 25~800 ℃의 온도 범위를 분당 10 ℃의 승온속 도로 열분해에 의한 중량 분석을 진행하였다. MgP의 경우 100 ℃ 이 상부터 무게의 감소를 보이다가 300 ℃를 기준으로 급격한 감소를 보 였으며, 650 ℃에 이르러서 유기물 부분이 완전히 연소되고 Mg, Si와 같은 무기물 부분만 연소되지 못하고 58.60 wt% 가량 남은 것을 확인 할 수 있었다. PLE의 경우 유기물로만 이루어져 100~200 ℃ 사이에 서 전부 연소되는 것을 확인하였다. PLE/MgP 시료들의 열분해 패턴을 확인하면, MgP와는 다르게 100~250 ℃구간에서 급격한 무게 감소를 보이고 있으며 합성 시 PLE의 비율이 증가할수록 더욱 무게 감소율이 커진다. 또한 열분해 후의 잔여물 또한 PLE의 비율이 커질수록, 즉 100~250 ℃구간에서의 무게 감소율에 따라 감소하여, PLE/MgP-1, PLE/MgP-2 및 PLE/MgP-3의 잔여물의 무게비는 각각 54.71, 51.44 및 49.66 wt%로 확인되었다. MgP 내의 PLE의 열 분해온도가 약 250 ℃ 까지 고온방향으로 이동한 이유는 MgP 층간에 삽입된 영향으로 열안 정성이 소폭 증가한 것으로 해석된다. 열분해 후의 잔여물의 wt%를 통해 MgP에 함유된 PLE의 loading capacity를 아래 식을 통해 계산할 수 있다.
이 식에서 RMgP는 MgP의 열분해 후 잔여물(residue)이며, RS는 각 샘플의 열분해 후 잔여물이다. 계산 결과를 Table 3에 나타내었으며, 결과적으로 열중량 분석을 통해서 실제 함유량이 MgP 대비 최대 10% 가량까지 함유되어 있는 것을 확인하였다.
솔잎 추출물은 다양한 세균에 대한 천연 항균제로서 널리 알려져 있으며[9], 표면에 amine기를 가지는 마그네슘-층상규산염 또한 우수 한 항균 활성을 가진다는 연구[30,31]가 보고된 바 있다. 본 연구에서 는 MgP와 PLE 및 PLE/MgP 시료들에 대해서 보통 산업에서 흔히 사 용되는 대장균(E. coli)과 피부 상재균인 포도상구균(S. aureus) 및 여 드름균(P. acnes)에 대한 항균 활성을 MIC법 및 MBC법을 통해 검토 하였으며 그 결과를 Table 4에 나타내었다. MgP의 항균 활성은 MIC 농도와 MBC 농도 모두 약 1,000~1,500 ppm으로 확인되어 그 자체로 도 뛰어난 항균력을 가지는 것을 확인하였다. PLE의 경우 그람 음성균 인 E. coli에서는 2,000 ppm 이상의 농도에서 항균 활성이 나타남을 확 인하였고, 그람 양성균인 S. aureus 및 P. acnes에 대해서는 500~1,000 ppm의 항균 활성을 확인하였다. 흥미롭게도 PLE/MgP 복합 소재의 경우에는 MgP 또는 PLE 각각의 항균 활성보다 더욱 우수한 항균 활 성을 보여주었다. 특히 PLE/MgP-3의 경우 피부 상재균인 S. aureus에 대해 250 ppm의 MIC 농도와 500 ppm의 MBC 농도를 나타내었으며, P. acnes에 대해 125 ppm의 MIC 농도와 250 ppm의 MBC 농도로 매 우 낮은 농도로도 효율적인 항균 활성을 보여준다. 이는 분자 단위로 세포질막을 통과해 균의 성장을 억제하며 세포막과 세포벽에 손상을 주는 솔잎 추출물의 항균 활성 메커니즘[32,33]과, 표면의 amine기를 사용하여 세포막에 탈분극을 가해 균의 표면 모폴로지를 변화시켜 최 종적으로 균을 사멸에 이르게 하는 마그네슘-층상규산염의 항균 활성 메커니즘[31]이 복합적으로 이루어져 각각의 소재들보다 더욱 향상된 항균 활성을 가지는 것으로 해석된다.
4. 결 론
본 논문은 one-pot silylation법을 이용하여 마그네슘-층상규산염(MgP) 과 솔잎 추출물(PLE)이 함유되어 있는 샌드위치 구조의 유/무기 복합 나노입자를 성공적으로 합성하였다. 합성된 물질의 결정 구조를 XRD 를 통해 분석한 결과 팔면체와 사면체 구조의 MgP가 합성되었음을 확인하였고, 층간거리(d-spacing)가 PLE의 비율에 따라 변화한다는 결 과를 통해 PLE가 MgP의 층간에 삽입되어 있다는 것을 확인하였다. HR-TEM을 통해 입자 크기가 100 nm 가량임을 확인하였고, PLE의 삽 입에 따른 입자의 모폴로지 변화를 관찰하였다. FT-IR 분광법을 통하 여 MgP의 화학 구조가 예상했던 모식도대로 합성되었는지를 확인하 였으며 표면의 amine기에 대한 peak 또한 확인하였다. 열중량 분석을 통해 MgP 내에 함유되어 있는 PLE의 열안정성이 약 50 ℃ 가량 증가 한 것을 확인하였으며, PLE의 함유량이 MgP 대비 10%까지 함유되어 있는 것을 확인하였다. MIC법 및 MBC법을 통해 대장균(E. coli)과 포 도상구균(S. aureus) 및 여드름균(P. acnes)에 대한 항균 활성을 검토 한 결과, PLE와 MgP의 항균 활성 메커니즘이 복합적으로 발현되어 MgP 또는 PLE 각각의 소재들의 항균 활성들보다 PLE/MgP의 항균 활 성이 더욱 낮은 농도에서 나타나는 것으로 확인되었다. 특히 PLE/MgP-3 의 경우 MIC 농도가 피부상재균인 S. aureus에 대해 250 ppm, P. acnes 에 대해 125 ppm로 낮은 농도로도 매우 효율적인 항균 활성을 보였 다. 화장품 소재 분야에서 피부 상재균에 대한 높은 항균 활성을 고려 할 때 이 소재의 적용이 가능할 것으로 보인다. 또한, 솔잎 추출물 외 에도 다양한 기능성 천연물 및 약물들을 사용하여 기능성 화장품 소 재, 의료용 소재, 공업용 첨가제 등의 다양한 분야로 적용이 가능하다 고 사료된다.
