1. 서 론
미강은 우리나라 농산물 중 생산량이 가장 많은 벼의 도정 부산물 로 과피, 종피와 호분층 등의 분쇄 혼합물로 현미 중량의 8.3-10.0% (w/w)를 차지한다[1]. 국내에서는 매년 40-60만 톤의 미강이 생산되지 만 일부만이 미강유 생산에 사용되고 대부분이 가축의 사료로 사용되 거나 폐기되는 실정이다. 쌀을 주식으로 삼는 일본 또한 연간 95만 톤 의 도정 부산물이 발생하며 세계적으로 매년 5,000만 톤의 미강이 생 산되고 있으나 효율적인 처리공정 미확립으로 대부분의 미강은 폐기 물로 처리되고 있는 실정이다[2].
최근 활성산소가 노화와 성인병 질환의 원인이 된다는 것이 알려진 이후 활성산소 제거능이 우수한 항산화제의 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있으며 이에 따라 세계적으로 항산화 물질을 포함하는 식품 에 대한 관심이 높아지고 보다 영양성과 기능성이 강화된 제품 개발 이 요구되고 있는 실정이다[3].
현재 식품산업에서 tert-butylhydroxyanisol (BHA)과 tert-butylhydroxytoluene (BHT)와 같은 합성 항산화제가 널리 사용되고 있지만 과량 섭취 시 간장, 폐와 신장에서 독성 작용을 나타내는 등 인체 안 전성 문제로 소비자의 반감이 높아져 α-토코페롤, 비타민 C, flavonoid와 carotenoid와 같은 천연 항산화제에 대한 관심이 높아지고 있다[4]. 하지만 부작용이 낮다고 알려진 천연 항산화제는 합성 항산 화제에 비해 항산화 효과가 상대적으로 낮고 높은 생산가로 인해 가 격 경제력을 가지기가 힘든 단점을 지닌다[5].
농산부산물인 미강은 탄수화물 34-52%, 단백질 12-16%, 식이섬유 20-25%와 지방 18-22%로 구성되어 영양학적으로 매우 우수하다 알 려져 있다. 또한 항산화 활성을 지닌 비타민(A, B1, B6, E), 철분 및 미네랄 등 다양한 영양소들이 함유되어 있으며 γ-오리자놀과 β-시 토스테롤 등 항산화 효과가 높은 물질을 포함한다고 알려져 있다[6]. 특히 γ-오리자놀은 쌀 구성성분 중 미강에만 존재하는 물질로서 페 룰산과 페루릭산 등과 함께 항산화 작용 및 콜레스테롤 저하 효과, 항 암 효과 및 항균 효과 등 다양한 생리활성을 나타내어 유지 식품의 산화 방지제나 화장품 및 의약품의 원료로 널리 사용되고 있다[7-9].
이러한 성분분석을 기초로 할 때, 항산화 소재 생산에 있어 농부산 물인 미강을 사용한다면 원료수급의 비용 절감에 따른 경제성 확보와 부산물 처리비용 절감이라는 장점을 함께 확보할 수 있다.
따라서 미강으로부터 항산화 물질 추출을 위한 효율적인 추출 공정 을 확립한다면 식품 산업 전반에서 미강의 부가가치를 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다[10]. 일반적으로 천연물의 생리활성물질을 추 출하는 방법은 열수 추출법, 속실렛 추출법, 고온 용매 추출법 및 기 계적 압착법 등이 있지만 수율이 낮고 설비 및 생산 비용이 높아 가격 경쟁력이 낮은 단점을 지닌다. 이러한 단점을 극복하기 위해 식품산 업에 있어 초음파 추출의 사용이 증가되고 있다. 초음파 추출법은 용 매 내에서 초음파의 공동(cavitation)효과에 의해 화학적 반응성을 향 상시키고 특정 성분의 추출 공정에 도입되어 효율을 높이는 효과가 있다고 알려져 있다[11,12].
본 연구에서는 농부산물인 미강으로부터 폴리페놀과 플라보노이드 와 같은 생리활성물질 생산 최대화를 위해 초음파를 이용한 추출을 적용하고 추출 조건을 반응표면 분석법을 이용하여 최적화하였다. 또 한 생리활성물질의 항산화능을 평가하여 미강으로부터 상업화 규모 생리활성물질 생산에 적합한 공정을 제안하여 식품 산업 전반에서 미 강의 활용 가치를 높이고자 하였다.
2. 실 험
2.1. 실험재료
본 연구에서 사용된 미강은 2017년 강원도 철원 생산 오대벼의 도 정 부산물로써 시중에서 유통되는 2017년산 국내산 미강(rice bran, 맑 은들 농업법인, Gangwon, Korea)을 구매하여 5 ℃ 냉장 보관하였으며 실험에 앞서 오븐(FC 49, Lab House, Korea)에서 60 ℃ 조건에서 12 h 건조시켜 중량 변화가 없음을 확인하고 실험에 사용하였다. 추출 용 매로 1차 증류수와 에탄올(Samchun, Korea, 99% v/v 이상)을 사용하 였으며 분석에 사용된 시약인 2 N folin-ciocalteu, 7.5% sodium carbonate (Na2CO3), aluminum chloride, potassium acetate, 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich사의 순도 99.5% 이상 시약 을 사용하였다.
2.2. 초음파 추출
초음파 추출을 위해 탁상형 초음파기(JAC Ultrasinic, Hwaseng, Korea)를 사용하였으며 실온에서 standing-bath 형태로 초음파(40 kHz, 200 W)를 이용하여 각각의 조건별로 추출하였다. 초음파 추출에 있어 폴리페놀, 플라보노이드 및 항산화능의 최대화를 위한 최적 조 건 확립을 위해 반응표면 분석법(surface response methodology, SRM) 을 사용하였으며 이는 일변수최적화(one factor at a time, OFAT) 기법 과 달리 다양한 독립변수간의 상호의존성을 고려하여 종속변수의 미 치는 영향을 파악하므로 보다 최적조건에 근접한 예측이 가능하다 [13]. 본 실험에서 추출 공정의 영향인자로 작용할 수 있는 독립변수 (Xn)는 기존의 일변수 실험의 결과에 기반하여 추출 시간(X1), 추출 온도(X2)와 에탄올 농도(X3)를 선정하였다. 독립변수의 범위는 Table 1 과 Table 2에서와 같이 5단계로 부호화하였고 총 17개의 조건을 설정 하여 초음파 추출 실험을 진행하였다. 미강 시료는 식품 분쇄기 (HMF-3000S, Hanil, Korea)로 분쇄한 후 40 mesh 이하의 분말을 사용 하였다. 건조 미강 0.25 g에 농도를 달리한 에탄올을 20배수를 첨가하 여 각 온도와 시간별로 초음파 추출을 진행하였으며 추출 후에는 1 mL 의 추출액을 마이크로튜브에 옮겨 냉동보관하여 분석실험에 사용하였다.
2.3. 총 폴리페놀(total phenolic content, TPC) 함량 측정
TPC 함량은 변형된 Folin-Ciocalteu법을 이용하여 측정하였으며[14] 미강 추출물 0.14 mL에 2 N Folin-Ciocalteu 시약 0.7 mL를 가하여 실온에서 8 min간 반응시켰다. 이후 반응액에 7.5% sodium carbonate (Na2CO3) 0.56 mL를 가하여 실온에서 1 h 동안 반응시키고 분광광도 계(UV1650PC, Shimadzu, Japan)에서 765 nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (CAS 149-91-7, Sigma, USA)를 사용하였으며 측정치는 mg gallic acid equivalent (GAE)/g dry matter (DM)으로 표시하였다.
2.4. 총 플라보노이드(total flavonoid content, TFC) 함량 측정
TFC 함량은 Mussatto 등의 방법을 변형하여 측정하였다[15]. 미강 추출 시료 0.5 mL에 증류수 2.8 mL, 99% (v/v) ethanol 1.5 mL와 10% aluminum chloride 0.1 mL 및 1 mol potassium acetate 0.1 mL를 순차 적으로 가한 후 혼합하여 실온에서 30 min간 방치하고 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 quercetin (CAS 117-39-5, Sigma, USA)을 사용하여 25, 50, 100, 150과 200 μg/mL로 희석하고 검량선 을 구하여 플라보노이드 함량을 산출하였다. 측정치는 mg quercetin equivalent (QE)/g dry matter (DM)으로 표시하였다.
2.5. 항산화능 측정
항산화능 측정 실험은 Brand-Williams 등의 방법으로 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성을 평가하였다[16]. DPPH 는 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 515-525 nm부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색 화합물이며[17] phenolic 화합물과 같은 전자공여체와 반응할 경우 전자나 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 되며 이에 흡수 band가 사라지면서 안정한 분자가 되고 전자가 비가역적으로 결합하는 수에 비례하여 탈색됨으로써 전 자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정할 때 사용된다 [18,19]. 전자공여능은 활성산소를 비롯하여 free radical에 전자를 공 여하여 무력화시키는 능력으로 산화를 억제시키는 척도를 나타낸다 [20]. 따라서 본 연구에서는 미강의 항산화능을 EDA (%)로 수치화하 였으며 추출 후 농축한 미강 시료 0.25 mL에 0.1 mol DPPH 1.25 mL 를 첨가하여 암실에서 20 min간 발색시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로 ascorbic acid (CAS 50-81-7, Sigma, USA)를 선정하여 비교하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. TPC 추출 최적 조건 탐색
페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어있는 2차 대사 산물의 하 나로서 flavonoid, tannin 및 catechin류 등으로 크게 구분된다[21]. 추 출 조건에 따른 미강의 TPC 함량은 1.13-3.19 mg GAE/g DM의 범위 로 나타났다(Table 3). ANOVA 분석에 따르면 추출액의 TPC 함량은 추출 용매의 에탄올 농도(p < 0.0266) 및 추출 온도(p < 0.0197)에 따 라 유의적인 차이를 나타내었으나 추출시간은 TPC 추출에 미치는 영 향이 유의하지 않음이 확인되었다. TPC 추출에 미치는 영향은 추출 온도 > 에탄올 농도 > 추출 시간 순임을 Figure 1의 일변수 최적화 그래프와 Table 4의 ANOVA를 통해 확인할 수 있어 추출 온도와 에 탄올 농도의 최적화가 선행되어야 함을 판단할 수 있다.
반응표면 분석법 중 하나인 중심합성계획법(central composite design, CCD)을 이용하여 구한 TPC에 대한 2차 회귀식은 Table 5에 나 타난 바와 같이, 회귀식의 적합도를 측정하는 척도인 결정계수인 R2은 0.8794이고 p < 0.0107로 적합도와 유의성이 인정되었다. 각각의 추출 조건에 따른 수율에 대한 반응표면 결과는 Figure 2에 나타내었다.
TPC에 가장 유의한 영향을 준다고 알려진 추출 온도의 경우, 표면 반응곡선인 Figure 2A에서 보는 바와 같이 온도가 증가함에 따라 TPC 수율이 비례하여 증가하였는데, 이는 고분자의 페놀성 화합물이 열처리에 의해 일부 결합이 분해되어 저분자의 페놀성 화합물로 전환 되었거나, 고온에서 단백질 및 전분이 분해되면서 이에 결합하고 있 던 페놀성 화합물이 유리형으로 전환되어 용출이 용이해진 것으로 예 측된다[22]. 추출 시간의 경우 시간이 증가할수록 폴리페놀 함량이 감 소하는 경향을 보이지만 유의적으로 큰 차이가 없으므로 추출에서 시 간의 영향이 미미함을 알 수 있었다. 이는 양배추 유용 성분 추출 조 건 최적화와 사과 pomace의 에탄올 추출에서 추출 시간은 폴리페놀 함량에 큰 영향을 주지 않는다는 연구 결과와 유사한 경향을 나타내 었다[23]. 에탄올 농도의 영향을 나타낸 Figure 2B와 2C에서 보는 바 와 같이 에탄올 50-60% (v/v) 구간에서 최대 추출능을 나타내었다. 미 강의 에탄올 초음파 추출 공정의 최고 수율은 50% (v/v)의 에탄올로 94 ℃에서 30 min 동안 추출한 조건(Run #12)이며 이 조건에서 폴리페놀 추출 농도는 3.19 mg GAE/g DM으로 나타났다.
3.2. TFC 추출 최적 조건 탐색
플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 성분으로 활성산소종을 효과적 으로 제거하여 항산화능, 항바이러스, 항염증 및 항암 효과가 있는 것 으로 알려져 있다[24]. 17개 추출 조건에 따른 미강의 TFC는 0.29-1.86 mg QE/g DM의 범위였으며(Table 3) 반응표면 분석법에 따 른 미강 추출액의 TFC 수율은 추출 온도(p < 0.0904)와 시간(p < 0.1058)에 비해 에탄올 농도(p < 0.0015)에 보다 크게 영향을 받음을 확인할 수 있었다(Figure 3, Table 4).
2차 회귀식에 기반한 표면반응곡선에 따르면 미강의 TFC 수율은 에탄올 농도가 높아짐에 따라 크게 증가하였으며 추출 온도의 경우 온도가 높아질수록 수율이 증가하다가 60 ℃ 이후의 온도에서는 큰 변화가 없음을 알 수 있었다(Figure 4). 이는 Min 등[25]의 대추잎 추 출 조건 최적화 연구에서 TFC가 에탄올의 농도에 큰 영향을 받는다 는 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 추출 시간에 따른 변화도 추출 온도와 유사하게 30 min 추출에서 가장 높은 TFC 수율을 확인 할 수 있었다. 이는 추출 온도와 시간이 증가함에 따라 플라보노이드 성분들이 유리형으로 전환되어 용출이 용이해지지만, 60 ℃ 이상의 고온에서는 열안정성이 낮은 성분들이 파괴되어 총 함량이 크게 증가 하지 않은 것으로 보인다. 추출조건 17개를 기준으로 미강의 에탄올 초음파 추출 공정의 최고 수율은 100% (v/v)의 에탄올로 60 ℃에서 30 min 동안 추출한 조건(Run #14)이며 이 조건에서 TFC 수율은 1.86 mg QE/g DM으로 나타났다. 회귀모델의 R2 값은 0.8497로 p < 0.03 수준에서 적합성과 유의성이 높음이 확인되었다.
3.3. DPPH 라디칼 소거능 최적 조건 탐색
DPPH 라디칼 소거능은 활성 산소의 산화 활동을 억제하거나 제거 하여 식품 중의 지방 산화를 억제하는 특성을 가지고 있으며, 체내에 서는 활성 산소에 의한 노화를 억제시키는 역할을 하고 있다[26].
미강의 초음파 추출 조건에 따른 항산화능은 24.9-46.6%의 범위였 으며(Table 3) 실험에 적용된 모든 독립변수에 유의한 영향을 받았다. 항산화능에 미치는 영향은 추출 온도(p < 0.0001) > 에탄올 농도(p < 0.0001) > 추출 시간(p < 0.0049) 순서임을 확인할 수 있었다(Table 4). 특히 추출 온도가 높아질수록 라디칼 소거능이 증가하는 경향을 보였 으며 이는 온도 증가에 세포벽 구성성분의 분해와 함께 물질 이동 증 가에 따라 항산화 물질의 추출 효율이 증가하였기 때문으로 판단된다 (Figure 5).
DPPH 라디칼 소거활성(%)에 대한 회귀식의 결정계수 R2은 0.9798 로 반응모형이 적합하였으며 통계적 유의성 또한 높게 나타났다(p < 0.0001). 반응표면곡선에서 보는 바와 같이 추출 시간의 경우 30 min 에서 라디칼 소거능이 가장 높은 값을 나타냈으며 이후 감소하는 경 향을 보였으며 에탄올 농도도 50-60% (v/v) 구간에서 최댓값을 나타 내었고 이후 감소하는 경향을 보였다(Figure 6).
실험에 적용된 17개 조건 중, 미강의 에탄올 초음파 추출 공정의 최 고 수율은 50% (v/v)의 에탄올로 94 ℃에서 30 min 동안 추출한 조건 (Run #12)이며 이 조건에서 DPPH 라디칼 소거능은 46.6%로 나타났 다. 이는 미강의 TPC 추출의 최적 조건과 같은 조건으로, 폴리페놀 화 합물들이 활성산소를 중화하는 항산화 작용을 하여 TPC 함량이 증가 함에 따라 DPPH 라디칼 소거능도 함께 증가하여 상호간의 연관성이 존재하는 것으로 확인되었다. 이는 Park 등[27]의 오미자 에탄올 추출 물의 항산화 특성 연구에서 총 폴리페놀 함량이 DPPH 항산화능과 매 우 높은 연관성을 지닌다는 연구 결과로 증명된 바 있으며 최적점에 서는 Oh 등[28]의 벼 품종별 도정 부산물 항산화 효과연구에서 각 품 종별 미강의 70% (v/v)에탄올 추출물이 평균적으로 42%의 DPPH 라 디칼 소거능을 나타낸 것과 비교 시 동등 이상의 수치를 확인하였다.
3.4. 최적 조건 탐색
미강의 생리활성물질과 항산화 물질 추출 조건을 최적화하기 위해 TPC, TFC와 DPPH 라디칼 소거능을 최대화 목적 변수로하여 반응표 면을 superimposing 하여 Figure 7에 나타내었다. 미강 추출물의 TPC, TFC와 DPPH 라디칼 소거능의 독립 최적조건으로 도출된 최대값의 반응표면을 중복시켜 공통되는 부분의 범위를 최적 추출 조건 범위로 결정하였다. 최적 조건 범위는 Table 6과 같이 추출 시간 5-55 min, 추출 온도 26-94 ℃, 에탄올 농도 0-100% (v/v)로 하였고 이로부터 최 적 추출 조건은 추출 시간 41.6 min, 추출 온도 94.9 ℃, 에탄올 농도 74.0% (v/v)로 도출되었으며 TPC 2.78 mg GAE/g DM, TFC 1.63 mg QE/g DM와 DPPH 라디칼 소거능 42.86%가 예측되었다. 초음파 추출 은 heavy-duty culture tube (Py.1636.04MP, Pyrex, UK)에서 밀폐된 상 태로 진행되었으며 추출 완료 후, 용기를 포함한 전체 반응계의 무게 감소가 0.1 g 이하로 큰 변화가 없어 추출용매 증발에 따른 에탄올 농 도차이가 크지 않음을 확인할 수 있었다. 검증을 위해 위의 조건에서 에탄올 초음파 추출 후 실험을 수행하였을 때, TPC 2.51 mg GAE/g DM, TFC 1.75 mg QE/g DM와 DPPH 라디칼 소거능 41.95%로 확인 되어 예측된 값과 유사한 수준으로 나타남을 알 수 있었다.
4. 결 론
본 연구에서는 미강으로부터 폴리페놀과 같은 생리활성 물질을 생 산하고 항산화능을 평가하는 데 있어서 반응표면 분석법을 이용하여 추출 조건을 최적화하였다. 통계학적 최적화 기법을 이용하여 미강 추출물의 TPC, TFC와 DPPH 라디칼 소거능을 최대화할 수 있는 초음 파 추출 조건을 확립하였으며 각 실험에서 최대값의 반응표면을 superimposing 하여 최적점이라 예상되는 추출 조건인 추출 시간 41.6 min, 추출 온도 94.9 ℃, 에탄올 농도 74.0% (v/v)를 예측하고 이를 검 증하였다. 실험 결과 Kim[29] 등의 백미 70% (v/v)에탄올 추출물이 TPC 1.30 mg GAE/g DM, TFC 0.15 mg QE/g DM, DPPH 라디칼 소 거능 12.71%와 비교 시 각각 2배-4배 이상 높은 값을 확인할 수 있었 으며 이를 통해 기존 용매 추출법 대비 초음파 추출공정이 생리활성 물질 추출에 보다 효율적인 공정임을 확인할 수 있었다.
도출된 결과를 기반으로 할 때, 농업 부산물인 미강의 초음파 추출 을 통해 항산화 기능을 가지는 고부가가치 생리활성 물질 생산이 가 능하여 항산화 물질 생산에 있어 원료수급의 비용 절감 효과가 기대 된다. 또한 식품 및 화장품 산업에 사용이 가능한 천연 항산화제의 상 업화 규모 생산에 있어서 경제성을 확보할 수 있어 산업 전반에 걸쳐 미강의 활용 가치를 높일 수 있을 것으로 보인다.