1 서 론
고령화 사회에서 노화방지에 대한 관심이 급증하면서 노화를 일으 키는 원인인 세포 내의 활성산소(reactive oxygen species)의 생성을 예 방하는 항산화물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포 내에 활성산소가 지나치게 많이 축적될 경우 항산화 시스템의 균형이 깨지 게 된다. 생채 내에는 항산화 효소 및 천연 항산화제가 존재하지만 더 욱 효과적으로 예방하기 위해 항산화 물질을 섭취하는 것이 좋다 [1-3]. 대표적으로 잘 알려진 항산화 물질로는 폴리페놀(polyphenol)이 있으며, 폴리페놀을 함유한 천연물에는 녹차, 블루베리, 안젤리카 등 이 있다[4-5]. 이 중 안젤리카(angelica)는 미나리과 식물로 프랑스나 벨기에 등지에서 서식한다. 허브의 한 종류로 약재 및 요리용으로 사 용하는데 대부분 잎, 줄기, 뿌리 등을 섭취한다. 안젤리카의 주성분으 로는 비타민A, 게르마늄, 철분 등이 있으며, 혈액순환강화, 빈혈, 류마 티스성 염증과 기관지염 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다[6].
추출공정의 최적화 설계방법으로 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하였다. 반응표면분석법이란 최적화 실험 계획법으로 반응치(response)에 영향을 주는 실험인자를 찾은 후 소수 의 중요인자를 이용하여 최적반응치를 찾는다. 이것은 현재보다 더 나은 공정을 원할 때 사용하는 분석방법이며, 수리 통계적 기술로 실 험설계법에 의해 실험하여 얻은 데이터를 모델함수에 최적화시킨다. 반응표면분석법은 실험목적 달성을 위한 품질특성값(y)의 반응치와 반응치에 영향을 주는 변수(x)를 나타내는 계량인자(quantitative factor)와 계수인자(qualitative factor)로 구성된다[7-10].
따라서 본 연구에서는 천연물 중 폴리페놀함량(total polyphenols)이 높은 안젤리카를 선정하여 안젤리카로부터 유효성분을 추출하기 위한 공정에 반응표면분석법을 적용시키고자 하였다. 추출공정의 계량인자 로는 추출시간, 추출온도, 주정/초순수 부피비 등을 이용하였고, 반응 치로는 추출수율(extraction yield)과 폴리페놀함량 등을 설정하였다.
2 실험방법
2.1 천연물로부터 유효성분의 추출
안젤리카로부터 유효성분을 추출하기 위해 용매 500 mL를 기준으 로 분쇄된 시료의 양을 20 g으로 고정하여 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 용매로는 초순수와 95%-주정을 이용하였으며, 주정/초순수 부 피비, 추출온도, 추출시간 등에 따라 추출된 유효성분을 정량하였다. 안젤리카로부터 추출된 유효성분의 정량은 냉동건조법(freeze drying method)을 이용하였다. 추출된 유효성분은 여과과정 후 진공증류를 통해 농축하였으며, -10 ℃로 6 h 동결한 후 냉동건조장치를 이용하여 0.9 bar, -20 ℃의 조건에서 24 h 건조하였다.
2.2 폴리페놀함량 분석
안젤리카로부터 추출된 유효성분의 폴리페놀함량은 자외선 분광광 도계를 이용하여 분석하였다. 폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteau micro method에 의해 수행되었으며[11], 검정곡선을 작성하기 위해 표준물 질로 gallic acid (Sigma-Aldrich, G7384)를 이용하였다. 표준용액의 농 도범위는 15~60 μL/mL이고, 자외선 파장은 765 nm에서 측정하였다. 폴리페놀의 정량을 위해 냉동건조한 시료 1 mL (1 mg/mL)에 20% sodium carbonate 0.4 mL와 1 M phenol reagent 1 mL를 혼합한 후 메탄 올을 이용하여 총부피를 5 mL로 제조하였다. 제조된 시료는 암실에 서 2 h간 방치한 후 자외선 분광광도계를 이용하여 정량하였다. 측정 된 흡광도는 검정곡선을 이용하여 gallic acid equivalents (mg GAE/g) 로 환산하였다[12].
3 결과 및 고찰
3.1 반응표면분석법의 변수설정
본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 추출공정의 추출조건을 최적화하였다. 실험계획법은 중심합성계획법을 이용하였으며 추출공 정에서 중요하게 고려되는 계량인자는 기초실험 결과를 바탕으로 추 출시간(2.5~3.5 h), 주정/초순수 부피비(55~65 vol%), 추출온도(55~ 65 ℃)로 선택하였다[13]. 안젤리카에서 추출시간, 주정/초순수 부피 비, 추출온도에 대한 최적의 조건을 찾기 위해 사용한 중심합성계획 법에 따라 설계된 20개의 조건을 이용하여 각 실험을 진행하였다. 반 응표면분석법에 의해 측정된 추출수율과 폴리페놀함량의 결과값을 Table 1에 나타내었다.
3.2 안제리카로부터 유효성분의 추출특성
Table 1의 실험결과를 바탕으로 반응표면분석법에 의해 산출된 안 젤리카의 추출수율에 관한 회귀방정식은 다음과 같다.
이 회귀방정식을 활용하여 추출수율에 따른 인자에 대한 영향을 Figure 1에 3차원 그래프와 등고선도를 나타내었다. 여기서 두 가지 인자에 대한 나머지 한 가지 인자의 고정값은 추출시간(3.0 h), 주정/ 초순수 부피비(60 vol%), 추출온도(55 ℃)로 하였다. 이러한 회귀 방 정식을 통해 변수의 주효과도, 교호효과도, 적합성 결여 등을 판단할 수 있다. 본 연구의 추출수율에 대한 주효과도인 추출시간, 주정/초순 수 부피비, 추출온도가 반응치에 영향을 끼치는 정도를 회귀방정식에 따른 값으로 수치화하면 추출시간 : 주정/초순수 부피비 : 추출온도 = 16.86 : 1.0 : 2.60이다. 또한 교호효과도인 추출시간 × 주정/초순수 부 피비 : 추출시간 × 추출온도 : 주정/초순수 부피비 × 추출온도의 비율 은 23.79 : -50.50 : 1.0로 나타났다. 주효과도만을 고려하면 추출시간 이 절대적으로 큰 영향을 끼치지만, 두 가지 인자의 조합에 따라 일어 나는 교호효과도를 고려한다면 추출시간과 추출온도의 조합이 가장 큰 영향을 끼치는 것을 알 수 있다. 또한 주효과도에서 상대적으로 낮 은 값을 갖는 주정/초순수 부피비와 추출온도는 교호효과도에서 가장 낮은 값을 나타났다.
Figure 2는 한 가지 인자에 대한 나머지 두 가지 인자의 값을 고정 하고 한 가지 인자의 값을 변화함에 따라 추출수율의 변화율을 나타 낸 그래프이다. 한 가지 인자에 대한 나머지 두 가지 인자의 고정값은 추출시간 2.8 h, 주정/초순수 부피비 64.0 vol%, 추출온도 56.6 ℃로 하였다. 각 인자의 실험범위는 추출시간(2.5~3.5 h), 주정/초순수 부피 비(55~65 vol%), 추출온도(55~65 ℃)이며 동일한 변화 범위를 위해 최적값을 기준으로 전체실험범위의 10% 전⋅후로 설정하였다. 위에 서 나타낸 추출수율에 관한 회귀방정식을 하나의 인자에 대한 2차 함 수로 변환함으로써 3인자 모두 최적값을 갖는 지점에서의 접접에 대 한 기울기를 수치화하였다. 이때 추출시간에 대한 최적값에서의 기울 기는 1.527이고, 주정/초순수 부피비에 대한 기울기는 -0.137, 추출온 도에 대한 기울기는 0.0338이 계산되었다. 이는 반응표면분석법을 이 용하여 얻은 추출수율에 대한 각 인자의 최적값은 기울기 값이 0에 가까운 추출온도가 가장 근접하게 도출되었다고 해석할 수 있으며 추 출시간에는 비례하는 경향을, 주정/초순수 부피비에는 반비례하는 경 향을 나타내는 것을 의미한다. 따라서 추출수율에 대한 계량인자의 주효과도와 교호효과도를 모두 고려하였을 때 가장 큰 영향을 미치는 인자는 추출시간인 것을 확인할 수 있었다.
반응표면분석법에 의해 계산된 안젤리카로부터 추출된 유효성분의 폴리페놀함량에 관한 회귀방정식은 다음과 같다.
이 회귀방정식식을 활용하여 추출수율에 따른 인자에 대한 영향을 Figure 3에 3차원 그래프와 등고선도를 나타내었다. 주효과도인 추출 시간, 주정/초순수 부피비, 추출온도가 반응치에 영향을 끼치는 정도 를 식 (2)의 폴리페놀함량에 관한 회귀방정식으로 수치화하면 추출시 간 : 주정/초순수 부피비 : 추출온도 = 335 : 7.5 : -1이다. 또한 교호효 과도인 추출시간 × 주정/초순수 부피비 : 추출시간 × 추출온도 : 주정/ 초순수 부피비 × 추출온도의 비율은 –13.91 : -12.39 : 1로 나타났다. 주효과도만을 고려하면 추출시간이 절대적으로 큰 영향을 끼치지만, 두 가지 인자의 조합에 따라 일어나는 교호효과도를 고려하면 추출시 간 × 주정/초순수 부피비과 추출시간×추출온도의 영향은 거의 동일하 게 나타난 것을 알 수 있다. 이는 추출시간에 비해 다른 두 인자의 영향 이 아주 미미하여 이러한 결과가 나온 것으로 판단된다. 또한 추출수율 과 마찬가지로 주효과도에서 상대적으로 낮은 값을 갖는 주정/초순수 부피비와 추출온도는 교호효과도에서 가장 낮은 값을 나타내었다.
Figure 4는 한 가지 인자에 대한 나머지 두 가지 인자의 값을 고정 하고 한 가지 인자의 값을 변화에 따른 폴리페놀함량 변화율을 나타 낸 그래프이다. 추출효율과 마찬가지로 추출시간, 주정/초순수 부피 비, 추출온도의 범위를 최적값을 기준으로 전체실험범위의 10% 전⋅ 후로 설정하였다. 위에서 나타낸 폴리페놀함량에 관한 회귀방정식을 하나의 인자에 대한 2차 함수로 변환함으로써 3인자 모두 최적값을 갖는 지점에서의 접접에 대한 기울기를 수치화하였다. 이때 추출시간 에 대한 최적값에서의 기울기는 -0.904이고, 주정/초순수 부피비에 대 한 기울기는 0.076, 추출온도에 대한 기울기는 -0.0158이었다. 이는 반 응표면분석법을 이용하여 얻은 폴리페놀함량에 대한 각 인자의 최적 값은 기울기 값이 0에 가까운 추출온도가 가장 근접하게 도출되었다 고 해석할 수 있으며 추출시간에는 반비례하는 경향을, 주정/초순수 부피비에는 비례하는 경향을 나타내는 것을 의미한다. 또한 주효과도 와 교호효과도를 모두 고려하였을 때 가장 큰 영향을 미치는 인자는 추출수율과 마찬가지로 추출시간인 것을 확인할 수 있다.
3.3 종합만족도 및 유의확률 평가
앞서 세 가지 인자(추출시간, 주정/초순수 부피비, 추출온도)에 따른 두 가지 요인(추출수율과 폴리페놀함량)에 대한 회귀식을 각각 얻었 으며, 그에 따른 표면도를 3차원 그래프와 등고선도로 나타내었다. 또 한 섭동 그래프를 통해 각 인자의 변화에 따른 반응치의 경향을 나타 내었다. 최종적으로 인자에 따른 요인에 대한 최적화를 하고자 한다. 추출수율과 폴리페놀 모두 최대값을 가질 수 있는 세 가지 인자에 대 한 최적 조건 그래프를 Figure 5에 나타내었다. 추출공정의 최적조건 은 추출시간 2.8 h, 주정/초순수 부피비 64.0 vol%, 추출온도 56.6 ℃ 로 나타났다. 이 조건으로부터 예상되는 요인의 값으로 추출수율은 24.6%, 폴리페놀함량은 8.76 mg GAE/g으로 산출되었다. 또한 추출수 율에 관한 회귀방정식의 결정계수(coefficient of determination, R2)는 81.4%이고, 폴리페놀함량에 관한 회귀방정식의 결정계수 R2은 75.4% 이었다. 이를 통해 결정계수 R2이 1에 더 가까운 값을 갖는 추출수율 에 관한 회귀방정식이 더 예측성이 좋은 모델이라 판단할 수 있다. 통 계학적 측면에서 귀무가설이 참일 때 귀무가설을 기각할 확률의 최대 값인 유의수준 α보다 유의확률 P-value가 더 작은 값을 갖을 때, 귀 무가설을 기각하고 대립가설을 채택한다. 이는 기존에 믿었던 사실보 다 새로운 실험을 통해 증명된 내용에 대해 더 높은 신뢰성을 부여한 다는 것을 의미한다. 본 연구에서 수율에 대한 P-value는 0.039가 나왔 고, 폴리페놀함량에 대한 P-value는 0.044가 나왔으며 이는 유의수준 α (= 005)보다 더 작은 값을 나타내므로 그 유의성은 5% 이내에서 인정 되었다. 또한 회귀방정식에 대한 종합만족도 D = 080이 산출되었다.
4 결 론
본 연구에서는 천연물로부터 항산화물질인 안젤리카로부터 폴리페 놀함량을 추출하기 위해 반응표면분석법을 사용하여 최적화된 공정 을 설계하였다. 반응표면분석법을 이용하여 추출공정의 최적화과정을 수행한 결과 추출수율과 폴리페놀함량 모두 계량인자의 주효과도와 교호효과도를 모두 고려하였을 때 가장 큰 영향을 미치는 인자는 추 출시간이었다. 또한 안젤리카의 최적추출조건은 추출시간이 2.8 h, 주 정/초순수 부피비 64.0 vol%, 추출온도 56.6 ℃이었으며, 이 조건의 추 출수율은 24.6%, 폴리페놀함량은 8.76 mg GAE/g으로 산출되었다. 추 출수율과 폴리페놀함량에 대한 회귀방정식의 결정계수 R2은 각각 81.4, 75.4%이었으며, 종합 만족도 D = 0.80, 유의성은 5% 이내의 수 준에서 인정되었다.
