1. 서 론

최근 화장품 및 의학 산업에서는 피부노화 관련 연구가 활발하게 진행되고 있다. 노화는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화 (extrinsic aging)로 나눌 수 있다. 내인성 노화는 시간이 지남에 따라 진행되는 자연적인 노화를 말하고, 외인성 노화는 자외선, 담배 연기, 미세먼지 등과 같은 환경인자들에 의해 진행되는 노화를 말한다. 특 히 자외선 노출은 외인성 노화의 주요 원인으로 자외선에 노출된 피 부는 라디칼 및 활성산소의 작용을 포함하는 산화적 스트레스 환경에 놓이게 된다. 이러한 산화적 스트레스는 피부 세포 구성 성분들인 지 질, 단백질 및 DNA 등 생체 분자들이 산화적 손상을 가져온다. 뿐만 아니라 결합 조직을 파괴시키는 matrix metalloprotainases (MMPs)의 발현을 촉진시켜 콜라젠 및 엘라스틴 등의 생체 고분자를 분해하고, 세포막 성분인 인지질을 산화시켜서 세포를 파괴한다. 이러한 세포 손상은 심각한 문제를 야기할 수 있다[1-8]. 이러한 산화적 스트레스 가 지속적으로 일어나면 세포 손상 뿐만 아니라 피부 노화가 촉진되 고 암과 같은 질병 발생 등 심각한 문제가 야기될 수도 있다[9,10].

자외선의 작용으로 발생하는 광산화적 손상 및 노화의 원인 물질에 는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 있다. ROS는 유해한 산소종으로, 종류에는 singlet oxygen (¹O₂), superoxide anion radical (O₂^⋅-⋅-), hydrogen peroxide (H₂O₂), hydroxyl radical (⋅OH), alkoxyl radical (⋅OR) 및 hydroperoxyl radical (⋅OOR) 등이 있다. 자외선에 의해 ROS가 생성되는 반응 중에서 광증감 반응은 특히 중요한 반응 이다. 체내에는 porphyrin이나 riboflavin과 같은 광증감 물질이 존재한 다. 이러한 광증감 물질이 자외선에 노출되면 피부에서는 광증감 반 응이 일어난다. 광증감 반응은 ¹O₂을 비롯한 다양한 종류의 ROS를 생 성시킨다. 광증감 반응은 Type I 반응과 Type II 반응으로 나눌 수 있 다. Type I 반응은 라디칼 또는 라디칼 이온이 생성되는 반응이고, Type II 반응은 다양한 종류의 ROS가 생성되는 반응이다. Type II 반 응의 주 생성물은 ¹O₂이고, 이외에도 부가적으로 다양한 ROS가 생성 되는데, ¹O₂은 반응성이 매우 큰 ROS로 생체 내에는 이를 제거할 수 있는 효소가 없고 특히 세포막 파괴 및 조직 손상에 주도적 역할을 할 수 있다[11-13].

피부에는 활성산소에 의한 손상을 예방하거나 회복하기 위해 다양 한 항산화 방어망이 구축되어있다. 항산화 방어망은 superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glutathione peroxidase 등의 항산화 효소와 vitamin E, vitamin C, glutathione 등과 같은 비효소적 항산화제들로 구성되어 있다. 하지만 이러한 보호 작용에도 불구하고 지속적인 외 부요인에 의해 활성산소가 과잉 생성됨으로써 항산화 네트워크가 붕 괴되면 피부의 세포, 조직 및 구성성분들은 산화적 손상을 받게 되고 피부 노화는 가속화될 수 있다[14-16]. 이와 같은 이유로 항산화 방어 시스템을 보완해줄 수 있는 천연 및 합성 항산화제 연구가 활발히 진 행되고 있다. 최근에 크게 각광받고 있는 분야인 천연 항산화제의 경 우는 합성 항산화제와 비교하여 상대적으로 안전성이 높은 장점이 있 다. 천연 항산화제 중 가장 활발하게 연구가 되고 있는 분야는 식물유 래 항산화제로 플라보노이드와 같은 페놀성 화합물들이 주성분들이 다. 천연의 플라보노이드는 대부분 배당체 형태로 존재하지만 당이 없는 아글리콘 성분들은 피부 흡수 및 항산화능이 배당체보다 일반적 으로 더 크다. 이러한 연구들은 저자들의 선행 연구에서도 여러 번 보 고한 바가 있다[17-19].

그라비올라(Annona muricata)는 남미⋅북미⋅필리핀⋅인도네시아 등 열대지방에서 재배되는 목련목 포도나무과로, 염증, 류마티즘, 당 뇨병, 고혈압, 불면증 및 기생충 감염 등을 포함한 질병의 치료에 광 범위하게 사용되어 왔다. 최근 그라비올라 추출물의 항산화 활성이 보고된 바 있다. 그 주성분으로는 nicotiflorin 등이 확인되었다[20,21]. Nicotiflorin은 kaempferol의 배당체로 식물의 잎에 주로 함유되어 있 으며, 항산화 활성에 대한 연구는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy (DPPH) 라디칼을 이용한 라디칼 소거활성만 보고되고 있다. 반면에 nicotiflorin의 아글리콘인 kaempferol에 대한 항산화 활성에 대한 보고는 있 으나, 그 배당체인 nicotiflorin과 비교하여 라디칼 소거활성, ROS 소 거활성 및 ¹O₂으로 유도된 세포 손상에서의 세포 보호 효과에 대한 비 교연구는 보고된 바 없다. 따라서 이번 연구에서는 그라비올라 잎 부 위에 포함된 nicotiflorin과 아글리콘 분획하여 얻은 kaempferol을 대상 으로 항산화 활성과 세포 보호 효과를 측정하고 그 메커니즘을 연구 하여 이를 보고하고자 한다.

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기

1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF), H₂O₂, luminol, heparin, rosebengal, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. FeCl₃⋅6H₂O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을 사용하였다. 완충용액 제조에 사용된 Na₂HPO₄ㆍ 12H₂O, NaH₂PO₄ㆍ2H₂O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 H₂SO₄, 에탄 올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용한 그라비올라 잎 은 2017년 5월 경동시장에서 구입하였다. Silica gel 60 F₂₅₄ thin layer chromatography (TLC)는 Merck (USA)사에서 구입하였다. 비교물질 로 사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (Korea) 를 통해 구입하였다.

적혈구 광용혈 실험에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을, UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT 를, pH 미터는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였으며, 물질분석을 위 해 HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 Shim-pack VP-ODS C₁₈ column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) 제품을 사용하였다.

2.2. 추출, 분리 및 분획

건조된 그라비올라 잎 200 g을 50% 에탄올 3 L로 추출하였다. 비 극성 성분을 제거하기 위해 50% 에탄올 추출물을 n-헥산으로 처리한 후 에틸 아세테이트로 분획하였다. 에틸 아세테이트 분획을 100% 에 탄올에 용해시키고, ethyl acetate : acetic acid : formic acid : distilled water (8 : 1 : 1 : 1)로 구성된 전개 용매를 사용하여 유리 TLC 판에 전개시켰다. 그라비올라 잎 에틸 아세테이트 분획에서 주성분으로 밝 혀진 nicotiflorin의 밴드(R_f 0.18)를 50% 에탄올로 추출한 다음, 건조 시키고 100% 에탄올에 용해시켰다.

Nicotiflorin으로부터 kaempferol을 얻기 위해 산 가수분해 방법을 이용하였다. Nicotiflorin에 5% H₂SO₄ 용액을 첨가한 후 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류ㆍ냉각시켰다. 환류 시킨 용액을 5% KOH-MeOH 용 액으로 중화시킨 후, 증류수로 씻고 에틸 아세테이트로 분획한 다음 건조시켰다. 얻어진 kaempferol은 실험에 사용하기 위해 100% 에탄올 에 용해하였다. Kaempferol과 nicotiflorin의 화학 구조를 Figure 1에 나타내었다.

2.3. Photohemolysis법을 이용한 세포 보호 효과 측정

2.3.1. 적혈구 분산액 제조

적혈구는 heparin이 첨가된 시험관에서 4 ℃의 냉장고에 보관하였 고 12 h 이내에 이용하였다. 이를 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심 분 리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.9% saline phosphate buffer (pH 7.4, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O 9.6 mM, NaH₂PO₄ㆍ2H₂O 1.6 mM)로 3회 반복하여 세척하였다. 모든 실험은 채혈 후 12 h 이내에 행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D. 값이 0.6 이 되도록 제조되었으며, 이때 적혈구 수는 약 1.5 × 10⁷ cells/mL로 계산된다.

2.3.2. 광용혈 억제 효과

1.5 × 10⁷ cells/mL 적혈구 현탁액 3.5 mL를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시료를 농도별로 각각 50 μL씩 첨가하였다. 암소에 서 30 min 간 pre-incubation시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (13 μM) 0.5 mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 15 min 동안 광 조사 하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행 이 되도록 배열한 후 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 시간 간격으로 700 nm에 서의 투광도(transmittance, %)를 통해 평가하였다. 적혈구 현탁액 투 광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 20 ℃항 온실에서 진행되었다.

적혈구의 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈정도로 구성 된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ₅₀을 구하여 비 교하였다. 모든 경우의 실험에서 대조군은 τ₅₀이 25.0 min으로 오차 범위 ± 1.0 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.

2.4. Singlet oxygen 소광 속도 상수

Singlet oxygen 소광 속도 상수 실험법은 이전 연구에 명시된 방법 을 참조 및 응용하여 진행하였다[22]. 광증감제로 rose-bengal을 사용 하였으며, 광증감 반응으로 발생된 ¹O₂ 양의 측정은 DPBF를 이용해 측정하였다. DPBF는 ¹O₂에 대하여 물리적 소광 작용을 하지 않고 화 학적 소광만을 한다고 알려져 있다. 따라서 DPBF는 ¹O₂과 정량적으 로 반응하기 때문에 DPBF의 감소량을 측정함으로써 ¹O₂의 양을 측정 할 수 있다.

메탄올을 용매로 사용하여 rose-bengal 24 μM, DPBF 15, 30, 60, 90 μM을 준비하였다. 시험관에 rose-bengal 1 mL, DPBF 1 mL를 넣고, 메탄올로 제조한 다양한 농도의 시료 1 mL를 첨가한 후 1 min간 조 사하였다. 조사 전과 후에 DPBF의 λ_max인 410 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 이와 같은 과정을 이용하여 DPBF의 4개의 농도에 대해 각 각의 흡광도 감소를 측정하였다. 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농 도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, Stern-Volmer식을 이용하여 ¹O₂ 소광 속도 상수인 K_q 값을 구할 수 있었다[22]. 공시험(Blank)으로 DPBF를 제외한 rose-bengal 1 mL, 메탄올 1 mL, 시료 1 mL를 시험관 에 넣고 410 nm에서 흡광도를 측정하여 rose-bengal과 시료의 영향을 보정하였다. 모든 과정은 암실에서 진행하였다.

2.5. 자유라디칼 소거 활성

자유라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 DPPH법을 이용하였다. 메 탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하 고 여러 농도의 시료 1 mL를 혼합하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 그 활성의 크기는 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 공시험 (blank), 시료를 넣지 않은 것을 대조군(control), 시료를 넣은 것을 실 험군(experiment)으로 하여 계산하였다. 자유라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC₅₀, μg/mL)로서 표기하였으며, 자유라디칼 (DPPH) 소거 활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.

2.6. ROS 소거 활성

ROS 소거 활성은 luminol이 활성산소종에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증 류수 1.78 mL를 넣고 여러 농도의 시료를 넣었다. 여기에 2.5 mM EDTA 40 μL 및 5 mM FeCl₃ㆍ6H₂O 10 μL를 가한 후 35 mM luminol 80 μL를 넣고 흔들어 섞어주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5 min 동안 항온시켰다. 그 후 Fenton 반응을 통한 활성산소종 생성을 위해 150 mM H₂O₂ 40 μL를 넣고 화학발광을 25 min 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H₂O₂와 FeCl₃ㆍ 6H₂O 대신 증류수를 첨가하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학발광으로 측정된 값은 다음 식으로 활성산소 소거율(%)을 계산하 였고, 활성산소 소거 활성의 크기는 화학발광의 세기가 50% 감소되는 데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, OSC₅₀)로 표기하였다.

2.7. 적혈구 세포 침투율

물질들이 적혈구 막 내부에 위치하는 것이 항산화 활성을 나타내는 데 영향을 미치는지 알아보기 위해 적혈구 세포 침투율 실험을 진행 하였다. 광용혈법을 이용한 세포 보호 효과 실험과 가장 유사한 조건 에서 실험을 진행하기 위해 동일한 조건으로 실험을 진행하였다. 동 일한 방법으로 적혈구 현탁액을 제조하였고, 투과율을 효과적으로 관 찰하기 위해 시료의 농도는 보호 효과를 관찰한 농도 중 가장 높은 농도인 25 μM로 설정하였다. 3.5 mL의 현탁액에 25 μM의 시료 50 μL를 넣고 암실에서 30 min 동안 incubation 시켰다. Rose-bengal을 대신해 0.9% saline phosphate buffer를 0.5 mL 첨가한 후 hand-mixing 시켰다. 침투하지 못한 시료를 제거하기 위해 시험관을 3,000 rpm으 로 5 min 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였고, 4 mL의 buffer 용액을 첨가하여 같은 과정을 3회 반복해 세척하였다. 마지막 상층액 을 제거한 후 100% EtOH 4 mL를 첨가하고 10 min 동안 초음파를 가해주었다. 마지막으로 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심 분리하여 적 혈구를 침전시킨 후 상층액을 분리했다. 이렇게 얻어진 상층액을 미 리 UV-scan을 통해 확인한 각 시료의 λ_max 파장에서 spectrophotometer를 이용해 정량하였다. 시료를 제외하고 용매를 첨가하여 동일 한 과정으로 blank를 측정하였고, 이를 이용해 각 실험군을 보정하여 적혈구의 영향을 보정하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. ¹O₂으로 유도된 적혈구의 파괴에 대한 세포 보호 효과

피부가 자외선에 노출되면 피부에 존재하는 porphyrin과 같은 광증 감제는 광증감반응을 일으켜서 singlet oxygen (¹O₂)과 같은 활성산소 를 생성시킨다. 이러한 활성산소는 세포막에서 막지질 자동산화 반응 과정으로 세포막을 손상시켜서 세포를 파괴시킨다. 본 연구에서는 광 증감제로 알려진 rose-bengal 및 적혈구 세포를 이용하여 ¹O₂으로 유도 된 산화적 세포 손상(광용혈)에 대한 항산화제의 보호 효과를 평가하 였다. 활성산소에 의해 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ₅₀) 으로 대조군 및 항산화제들의 세포 보호 효과를 비교 평가하였다.

본 연구에서는 활성산소로 유도된 광용혈 시스템에서, nicotiflorin 및 kaempferol을 각각 1, 5, 10 및 25 μM의 농도로 처리하고 그 보호 효과를 확인하였다(Table 1). Nicotiflorin의 τ₅₀은 1, 5, 10, 25 μM에 서 각각 26.6, 27.1, 27.3, 32.7 min, kaempferol은 각각 40.0, 58.9, 91.9, 206.3 min으로 농도 의존적인 세포 보호 효과를 나타내었고, kaempferol은 그 배당체인 nicotiflorin에 비하여 농도별로 1.5, 2.2, 3.4, 6.3배 더 큰 보호 효과를 보였다. 비교 대조군인 지용성 항산화제 (+)-α-tocopherol 또한 농도 의존적인 효과를 나타냈다. 하지만 수용성 항산화 제 L-ascorbic acid는 유의적인 보호 효과를 나타내지 않았다. 특히 kaempferol은 25 μM에서 (+)-α-tocopherol에 비하여 3.9배 큰 보호 효과를 나타냈다. 농도 의존적인 kaempferol의 세포 보호 효과를 Figure 2에 나타내었다. Nicotiflorin과 비교하여 그 아글리콘인 kaempferol의 월등한 세포 보호 효과에 대한 메커니즘을 규명하고자 하였다. 이와 함께 kaempferol과 그 배당체인 nicotiflorin의 세포 보호능 차이에 대 한 원인을 분석하고자 하였다.

3.2. Singlet oxygen 소광 속도 상수

세포 보호 효과가 나타날 수 있는 경로 중 하나는 Type II 광증감 반응의 주 생성물인 singlet oxygen을 효과적으로 소광 시키는 것이다. 다시 말해 세포 보호 효과의 원인으로 가장 먼저 예상할 수 있는 항산 화 능력이 ¹O₂ 소광 효과이다. 광증감제인 rose-bengal에 의해 생성된 ¹O₂은 매우 반응성이 큰 활성산소로 세포막에서의 라디칼 연쇄반응을 개시시키고 이어서 세포막을 파괴시킨다. 따라서 ¹O₂을 소거하면 세 포막에서의 라디칼 연쇄반응의 개시 단계를 차단시킬 수 있다. ¹O₂ 소 광 속도 상수 측정에는 rose-bengal을 사용하였다. 데이터는 Stern- Volmer식을 이용해 나온 K_q 값으로 나타내었다(Table 2).

¹O₂ 소광 속도 상수 측정에서 양성 대조군으로는 우수한 ¹O₂ 소광 제로 알려진 β-carotene을 사용하였고 본 실험에서 측정한 β-carotene의 소광 속도상수 값인 K_q는 2.1 × 10¹⁰ M^-1S^-1으로 문헌에서 제시 된 속도상수(2.6 × 10¹⁰ M^-1S^-1)와 유사한 결과를 나타내었다[22]. L-Ascorbic acid와 (+)-α-tocopherol의 Kq 값은 각각 1.1 × 10⁸ M^-1S^-1 및 1.7 × 10⁸ M^-1S^-1이었다. Nicotiflorin과 kaempferol의 K_q 값은 각각 1.1 × 10⁸ M^-1S^-1, 1.4 × 10⁸ M^-1S^-1로 나타났다. Kaempferol의 세포 보 호 효과는 (+)-α-tocopherol보다 현저히 뛰어났지만 ¹O₂ 소광 능력에 서는 큰 차이를 나타내지는 않았다. 이와 같은 결과는 kaempferol이 뛰어난 세포 보호 효과를 설명하는데는 ¹O₂ 소광 능력뿐만 아니라 다 른 기여 인자들이 있을 것으로 판단되었다. Table 3

3.3. 자유라디칼 소거 활성

광증감 반응이 일어나면 Type I 반응으로 라디칼 종들이 생성될 수 있다. 또한 singlet oxygen에 의해 세포막 구성성분인 인지질의 탄소사 슬에서 라디칼이 생성되고 이는 지질과산화 연쇄반응을 야기한다. 이 렇게 생성된 산화 인지질은 탄소사슬 부위에 산소를 가지고 있기 때 문에 이전과 같은 소수성 성질을 가지지 못한다. 따라서 더 이상 막 구조를 유지하지 못하고 세포 용혈 현상이 일어나게 된다.

자유라디칼 소거능이 kaempferol의 우수한 세포 보호 효과를 나타 내는데 기여했는지를 알아보고자 하였다. Nicotiflorin 및 kaempferol 의 라디칼 소거 활성(FSC₅₀)은 각각 910.0 및 6.8 μM로 나타났으며, 비교물질로 사용된 (+)-α-tocopherol 및 L-ascorbic acid는 12.8 및 13.9 μM로 나타났다. Kaempferol의 라디칼 소거활성은 매우 컸다. 따 라서 자유라디칼 소거 활성이 세포 보호 효과에 기여한 것으로 판단 된다. 반면 nicotiflorin은 매우 낮은 라디칼 소거 활성을 보였는데, 이 처럼 같은 분자 구조를 가진 물질이라도 배당체의 유무가 항산화 활 성에 매우 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 따라서 배당체와 아 글리콘 사이의 세포 보호능 차이를 반영한 결과라고 여겨진다. 하지 만 L-ascorbic acid는 세포 보호 효과를 나타내지 않았다. In vitro에서 라디칼 소거 활성이 높은 것이 세포수준에서의 세포 보호 효과가 큰 것은 아님을 보여주었다.

3.4. ROS 소거 활성

Type II 광증감 반응의 주 생성물은 ¹O₂이지만, 그 외에 O₂^⋅-⋅-을 비 롯한 다양한 ROS가 생성될 수 있다[13]. 이들 ROS들도 추가적인 산 화적 스트레스를 일으켜서 세포와 조직에 손상을 가한다. 뿐만 아니 라 본 연구에서 사용한 ROS 생성계는 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 시스템으로 ROS 소거활성은 킬레이팅 효과도 포함되어 있다. 즉 킬레이팅 효과 에 의한 ROS 생성 억제도 항산화능에 포함되어 있다. Fe³⁺-EDTA/ H₂O₂계에서는 Fe³⁺-EDTA와 H₂O₂의 작용으로 Fe²⁺-EDTA와 O₂^⋅-⋅-이 생성된다. 생성된 O₂^⋅-⋅-는 Fe³⁺-EDTA를 Fe²⁺-EDTA로 환원시킨다. 이 렇게 생성된 Fe²⁺-EDTA는 Fenton 반응에 의해 H₂O₂와 반응하여 ⋅OH와 같은 반응성이 매우 큰 ROS를 생성시킨다. 따라서 ¹O₂을 제 외한 O₂^⋅-⋅-, H₂O₂, ⋅OH 등의 대부분의 ROS가 생성되기 때문에 ¹O₂을 제외한 다른 ROS의 소거 능력만을 확인하려는 목적에 부합하는 모델 이라 할 수 있다. 활성산소에 의해 루미놀은 들뜬 상태인 아미노프탈 산으로 되고 이어 바닥상태로 떨어지면서 420-450 nm에서 발광하는 특성을 가진다. 이 계에 항산화제를 첨가하여 화학발광이 50% 감소하 는데 필요한 시료의 농도로 ROS 소거활성(OSC₅₀) 또는 총항산화능을 나타내었다.

Kaempferol 및 nicotiflorin의 ROS 소거 활성(OSC₅₀)은 각각 0.4 및 8.0 μM로 나타났으며, 비교물질로 사용된 (+)-α-tocopherol 및 L-ascorbic acid는 각각 9.0 및 5.2 μM로 나타났다. Kaempferol의 총 항산 화능이 가장 크게 나타났으며, 이는 kaempferol의 뛰어난 세포 보호능 이 자유라디칼 소거 활성뿐만 아니라 여러 가지 ROS에 대한 총 항산 화능에 의한 결과라고 예상된다. Nicotiflorin의 경우에는 kaempferol 보다 총 항산화능이 떨어졌지만, (+)-α-tocopherol보다 우수하였는데 이는 세포 보호 효과와 일치하지 않았다. 그러나 L-ascorbic aicd는 라 디칼 소거 활성과 마찬가지로 ROS 소거에서도 뛰어난 활성을 보였지 만 세포 보호 효과를 나타내지 않았다. Figure 3

3.5. 적혈구 세포 침투율

광증감 반응에 의해 생성된 라디칼 종, ¹O₂, 다양한 ROS는 매우 높 은 반응성으로 빠른 속도로 세포를 손상시키기 때문에 항산화 물질의 위치 또한 세포 보호 효과에 영향을 미칠 수 있다. 뿐만 아니라 ¹O₂에 의해 인지질 탄소 사슬에 형성되는 라디칼은 세포막 내부에 존재하면 서 연쇄 반응을 일으키기 때문에 항산화 물질이 세포막 내부에 존재 하지 않는다면 효과적으로 세포 용혈을 막을 수 없다. 따라서 항산화 물질이 세포와 독립적으로 존재하는 것보다 세포막 사이에 존재할 때 더 효과적인 세포 보호 효과를 나타낼 수 있다. 세포 침투율에 대한 실험 결과는 “침투한 양(μM)/초기에 넣어준 양(25 μM) × 100(%)”로 나타내었다(Figure 4).

그 결과, 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol의 침투율은 25.4%, 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid는 0.3%이었다. L-Ascorbic acid의 세포 침투율은 낮게 나타났다. L-Ascorbic acid의 0.3%는 세포막이 아 닌 세포내 존재 가능성이 더 클 수 있고 세포막에서의 자동산화반응 억제에는 그 역할을 나타내지 못할 수도 있을 것으로 판단된다. 아글 리콘인 kaempferol의 경우 18.1%의 적혈구 세포 침투율을 나타내었 고, 배당체인 nicotiflorin은 3.6%의 침투율을 나타내었다. Kaempferol 은 nicotiflorin에 비하여 세포 침투율이 5배 컸다. Kaempferol의 큰 세 포 침투율은 매우 큰 세포 보호 효과를 나타내는데 결정적 역할을 한 것으로 판단된다. 활성산소로 개시된 세포막에서의 라디칼 자동산화 반응은 초기에 kaempferol이 효율적으로 차단시키면 세포를 온전히 보호할 수 있다. 한편 세포 보호 효과가 매우 낮은 nicotiflorin과 L-ascorbic acid는 세포 침투율이 매우 낮았다. 따라서 효율적인 세포 보호 효과를 나타내지 못했다. 따라서 세포 침투능은 물질의 극성도가 반 영되었음을 나타낸다. (+)-α-tocopherol은 kaempferol보다 많은 양이 세포막에 침투하였고 ¹O₂ 소광 효과는 거의 유사했지만 세포 보호 효 과가 훨씬 작았다. 따라서 kaempferol의 우수한 자유라디칼 또는 ROS 소거 활성도 세포 보호 효과에 영향을 주었음을 알 수 있었다. 반면 L-ascorbic acid는 자유라디칼 및 ROS 소거 활성이 nicotiflorin 및 (+)- α-tocopherol보다 뛰어났으나 세포 보호 효과를 보이지 않았다. 이는 L-ascorbic acid가 수용성 항산화제로 세포막 내부에 침투하지 못했기 때문으로 사료된다. 따라서 세포를 보호하기 위해서는 적혈구 세포 내에 침투하는 능력이 필수적임을 확인하였다. 결론적으로, 광증감 반 응으로부터 세포를 보호하는 메커니즘에는 세포 내로 침투하는 능력, 자유라디칼 소거 활성 및 ROS 소거 활성이 중요한 요인으로 작용한 다는 것을 확인할 수 있었다.

4. 결 론

본 연구에서는 그라비올라의 주성분으로 밝혀진 nicotiflorin을 분리 하고 이를 아글리콘 분획하여 kaempferol을 얻음으로써 이들의 세포 보호 효과를 확인하고, 그 보호 메커니즘을 규명하였다. 비교물질로는 L-ascorbic acid, (+)-α-tocopherol을 사용하였다.

¹O₂로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과는 kaempferol > (+)-α-tocopherol > nicotiflorin >>> L-ascorbic acid 순이었다. 세포 보호 효과 메커니즘을 알아보기 위해 nicotiflorin, kaempferol 및 양성 대조군들 의 ¹O₂ 소광능, 자유라디칼 소거 활성, ROS 소거 활성을 평가하였다.

L-Ascorbic acid의 경우 자유라디칼 소거 활성, ROS 소거 활성에 서 모두 높은 효과를 나타냈지만 세포 보호 효과는 나타나지 않았다. 이는 세포 침투율이 매우 낮은데 기여한 것으로 판단된다. 따라서 세 포 수준에서의 보호 효과는 항산화제의 세포막 내부 존재가 중요한 것으로 생각된다[23]. (+)-α-Tocopherol의 경우 kaempferol 보다 더 낮은 세포 보호 효과를 나타내었다. (+)-α-Tocopherol은 kaempferol 과 비교하여 세포 침투율은 컸고 ¹O₂ 소광 속도 상수는 유사하였다. Type I 반응으로부터 생성되는 라디칼 종들에 대한 소거 활성과 Type II 반응으로부터 부가적으로 생성되는 각종 ROS에 대한 소거 활성은 kaempferol이 (+)-α-tocopherol보다 월등한 항산화 능력을 보였다. 이 를 종합해 볼 때 세포 보호 효과는 ¹O₂ 소광 능력, 세포 침투율, 라디 칼 및 ROS 소거 활성이 모두 반영된 것으로 판단되었다.