1. 서 론

최근 질병진단을 위한 디바이스는 빠르고 간단하게 측정할 수 있는 기능들을 요구하고 있어서 면역분석법(immunoassay)을 기반으로 한 질병 검출 방법들이 많이 사용되고 있다[1-5]. 이는 항체를 사용하여 진단하려고 하는 샘플을 항체와 항원의 반응을 통하여 질병을 검출하 는 방법이다. 면역분석을 위하여 사용되는 방법으로 항체와 항원의 결합을 효소의 반응에 의하여 나타내는 색으로 분석하는 효소면역측 정법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사성 동위원소의 항체와 항원의 반응을 사용하여 질병을 진단하는 방사면역측정법(radioimmunoassay), 항체와 항원의 반응을 화학발광을 통하여 분석하는 화학 발광 면역분석법(chemiluminescence immunoassay) 등이 있다[6-9]. 그 러나 이러한 방법들은 분석시간이 길고 고가의 장비와 전문인력이 필 요한 단점을 가지고 있다. 측방유동면역분석법(lateral flow immunoassay) 은 분석하려는 샘플을 스트립 안에 흐르게 함으로써 항체와 항 원의 면역반응을 이용한 질병을 검출하는 방법이며, 스트립 안쪽의 샘플이 모세관현상에 의하여 멤브레인 쪽으로 이동하게 된다[10]. 또 한 측방유동면역분석법은 고가의 장비 및 전문인력이 필요 없으며 검 출시간이 빠르고 가격이 싸다는 장점을 가지고 있다. 하지만, 다른 측 정 방법들에 비해서 상대적으로 검출한계(limit of detection)가 낮다는 단점이 있다. 측방유동면역분석법의 스트립은 샘플패드(sample pad), 접합패드(conjugation pad), 멤브레인(membrane), 흡수패드(absorbent pad)로 구성되어 있으며, 특히 접합패드에 담지하는 금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)와 항체(antigen) 간의 상호간 인력에 따라서 스트 립 센서의 민감도가 많은 영향을 받는다.

현재 질병진단을 하기 위한 측방유동면역분석에서 주로 사용하는 물질은 금나노입자이며 금나노입자를 사용하는 이유는 합성하기 쉽 고 다른 금속나노입자보다 안정적인 장점을 가지고 있기 때문이다 [11]. 또한 금나노입자의 물리적, 광학적 성질 때문에 질병진단, 질병 치료, 약물전달 등에서 많이 활용되고 있다[12]. 금나노입자의 물리적 성질로는 520 nm의 파장대를 흡수하는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)현상을 가지고 있으며 이로 인하여 금나노입자는 매우 강한 흡광성질을 가지고 있다[13]. 그리고 금나노입자는 마이크 로 또는 나노크기일 때 각각 다른 색상을 나타내는 광학적 특성을 가 지고 있다. 금나노입자를 합성하는 방법으로는 주로 HAuCl₄를 구연 산염으로 환원시켜 제조하는 Turkevich-Frens 합성법을 사용하며 다 양한 사이즈를 제조할 수 있다[14,15]. 또한 금나노입자는 다른 금속 나노입자보다 쉽게 표면개질 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 금나노 입자의 표면개질은 금나노입자가 쉽게 뭉치게(aggregation)되는 현상 을 최소화 시키며 수용액 내에서 안정적인 콜로이드(colloid) 형태를 띠게 한다.

본 연구에서는 Turkevich-Frens 합성법으로 금나노입자를 제조하였 으며 mercaptoundecanoic acid (MUA)와 L-lysine 등의 단분자들을 사 용하여 금나노입자의 표면개질을 진행하였다. 금나노입자의 표면개질 은 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectroscopy)를 통한 흡광도 세기변화와 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectroscopy)의 금나노입자 표면 작용기 분석을 통하여 확인하였다. 표면개질된 금나노입자와 항체 간의 접합(conjugation) 최적화를 위하 여 상기 분산액의 pH와 항체 농도를 조절하였다. 금나노입자의 작용 기 효과에 따른 측방유동면역분석 성능을 분석하기 위하여 B형 간염 표면항원 면역스트립 센서를 제작하였다. L-lysine으로 표면개질된 금 나노입자기반의 면역스트립 센서가 뚜렷한 발색과 낮은 검출한계를 나타내었다.

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기

금나노입자 제조 및 표면개질을 위한 gold chloride (HAuCl₄⋅ 3H₂O), trisodium citrate (S1804), mercaptoundecanoic acid (450561), L-lysine (L5501) 등을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 금나노입자/ 항체 간의 접합을 위하여 bovine serum albumin (A2153)와 sucrouse (31367-9001)는 Sigma-Aldrich와 Junsei로부터 각각 구입하였으며, hepatitis B surface antigen (13200)과 antibody (13101), goat anti- mouse IgG (20300)는 Boreda Biotech로부터 구입하였다. 측방유동 면역분석 스트립제조를 위하여 샘플패드(grade 319), 접합패드(grade 805), nitrocellulose 멤브레인(LFNC-C-SS₂505), 흡수패드(grade 222) 는 Boreda Biotech로부터 구입하였다.

2.2. 금나노입자의 제조

금나노입자는 Turkevich-Frens 합성법에 따라서 제조되었다[14,15]. 먼저, 3구 라운드 플라스크에 2.2 mM의 sodium citrate 용액을 150 mL 첨가한 뒤 98 ℃로 가열하였으며, 이후 15 min 동안 400 rpm으로 교반하였다. 25 mM의 gold chloride 용액을 1 mL 첨가한 후 10 min 동안 교반하였고 금나노입자 분산액 3 mL를 채취하였다. 상기 합성 법에 따라 얻어진 금나노입자 seed 분산액의 온도를 90 ℃로 낮추고 25 mM의 gold chloride 용액을 1 mL를 넣어준 뒤 30 min간 반응시켰 으며 상기 실험을 반복 수행하였다. 금나노입자의 성장을 위하여 분 산액을 55 mL 채취한 뒤 초순수 증류수 53 mL와 60 mM의 sodium citrate 용액 2 mL와 혼합한 후 20 min간 교반하였다. 마지막으로 25 mM의 gold chloride 용액 1 mL를 추가적으로 투입한 후 30 min간 교 반하였으며, 이를 반복함으로써 금나노입자 분산액을 제조하였다. 상 기 제조된 분산액은 재료분석과 센서 제작을 위하여 냉장보관 하였다. 금나노입자의 입자크기 및 구조는 투과전자현미경(transmission electron microscopy (TEM), JEOL Ltd., JEM-2100F)으로 분석하였으며, 광학적 특성은 UV-vis spectroscopy (Optizen 2120UV)를 이용하였고, 표면 화학구조를 분석하기 위하여 X선 광전자분광기(X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)를 사용하였으며, 금나노입자의 관능기 분 석을 위하여 Fourier transform infrared spectroscopy (Jasco, FT/ IR-4600)를 이용하여 분석하였다.

2.3. 금나노입자의 표면개질

금나노입자의 MUA와 L-lysine 표면개질은 아래와 같은 방법으로 수행하였다. 3구 라운드 플라스크에 금나노입자 분산액 50 mL를 넣 은 뒤 98 ℃로 가열한 후, 0.3 mM의 MUA 용액을 1 mL를 넣은 뒤 1 h 동안 교반하였으며 냉장 보관하였다. 또한 L-lysine으로 표면개질 방법은 다음과 같다. 5 mM의 L-lysine 용액을 10 mL 넣은 뒤 1 h 동 안 교반한 후 냉장 보관하였다.

2.4. 표면개질 된 금나노입자와 항체 접합 최적화

MUA와 L-lysine으로 표면개질 된 금나노입자와 항체를 접합 최적 화를 위하여 pH와 hepatitis B surface antibody의 농도를 조절하였다 [16]. 먼저 표면개질 된 금나노입자 분산액 2 mL를 10 mL vial에 넣고 0.25 M K2CO₃를 이용하여 pH 5~10까지 적정하였으며 pH를 조절한 금나노입자 분산액을 UV-vis spectroscopy를 이용하여 흡광도를 비교 하였다. 이후 10 wt% NaCl 100 μL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입 자의 변화를 확인하였다. pH가 최적화된 금나노입자를 이용하여 hepatitis B surface antibody의 농도(0.5~10 μg/mL)에 따라서 접합 최적 화를 진행하였으며 rotator를 이용하여 20 rpm으로 30 min 동안 표면 개질된 금나노입자와 항체를 접합하였다. 항체의 농도를 조절한 금나 노입자/항체 접합체를 UV-vis spectroscopy를 이용하여 흡광도를 비교 하였다. 이후 10 wt% NaCl 100 μL를 첨가하여 표면개질 된 금나노입 자/항체의 변화를 확인하였다.

2.5. 면역스트립 센서제작

면역스트립 센서는 샘플패드, 접합패드, 멤브레인, 흡수패드 구성요 소들의 조립으로 제작되었다. 먼저, 접합패드는 0.05 wt% polyvinyl alcohol (PVA)와 0.05 wt% Tween 20 용액에 담지한 뒤 상온에서 진 공오븐 60 ℃에서 2 h 동안 건조한 후 사용하였다. nitrocellulose멤브 레인의 test line과 control line의 항체는 각각 hepatitis B virus antibody와 goat anti-mouse IgG를 1 mg/mL씩 분주한 후 상온에서 건조 시켰다. Backing card를 back-bone structure로 사용하여 각 구성요소 들을 결합시킴으로써 스트립 센서를 제작하였다. 스트립 테스트를 위 하여 항원의 농도(100 μg/mL~1 ng/mL)에 따라 100 μL씩 떨어뜨린 후 test line과 control line의 발색을 확인하였다.

3. 결과 및 고찰

금나노입자 제조를 위한 Turkevich-Frens 합성법은 전구체인 HAuCl₄ 용액에 환원제인 citrate를 첨가하여 Au³⁺ 이온이 Au 나노입자가 생성 되게 하는 방법이다. 보다 균일한 금나노입자를 제조하기 위하여 본 연구에서는 Turkevich-Frens합성법으로 금나노입자 seed를 먼저 형성 시키고, 이후 gold chloride 용액을 첨가하면서 Au3+들이 형성된 seed 표면 위에 흡착된 후 추가 환원시켜 금나노입자의 크기를 조절하였다. 금나노입자의 크기는 금 전구체 및 citrate 농도와 증착 횟수에 따라서 조절이 가능하다[14-18]. 제조된 금나노입자의 표면처리를 위하여 -COOH그룹기를 가지는 MUA와 -COOH와 -NH₂ 그룹기를 가지는 L-lysine를 사용하여 citrate 분자로 막 형성된 금나노입자와 conjugation 시켜주었다(Figure 1).

투과전자현미경을 사용하여 기능화된 금나노입자가 구형태의 입자 임을 확인하였으며, 균일한 평균입도 크기(16.7 ± 2.1 nm)를 가짐을 확인하였다(Figure 2a). Figure 2b는 MUA와 L-lysine으로 표면개질된 금나노입자의 자외선-가시광선 분광광도계 결과를 보여주고 있다. 표 면개질 전의 금나노입자와 비교하여 520 nm에서의 흡광도 세기가 낮 아지는 것을 관찰하였다. 이는 자외선 영역의 특정 파장의 흡수 및 산 란 시 금나노입자의 표면개질에 의한 localized surface plasmon resonance (LSPR)현상에 기인한 것이다[19]. 단분자들에 의해서 기능화된 금나노입자는 안정적인 콜로이드 형태로 수용상에 분산되어 있음을 확인하였다. 투과전자현미경 관찰을 통한 기능화된 금나노입자와 항 체가의 표면 형상은 항체들이 균일하게 금나노입자 표면을 둘러싸고 있음을 확인하였다(Figure 2b).

기능화된 금나노입자의 표면 관능기를 분석하기 위하여 Fourier transform infrared spectroscope를 사용하였다. Figure 3는 MUA와 L-lysine으로 표면개질된 금나노입자의 FT-IR 스펙트럼들을 보여주고 있다. 순수한 금나노입자 표면 관능기와 비교하여 MUA로 표면개질 된 금나노입자에서는 2,850와 2,916 cm^-1에서 포화된 alkyl의 stretching vibration피크가 관찰되었다(Figure 3a). 또한 AuNP/MUA 표면에 서 -SH ligand (2,556 cm^-1) 피크가 소멸된 것으로 보아 금나노입자의 citrate 분자와 ligand exchange가 일어났음을 확인할 수 있었다. 또한 MUA와의 결합 후 -OH, C=O (1,579 cm^-1), C-H (1,399 cm^-1) 피크들 이 이동한 것으로 보아 MUA와 citrate간에 반데르발스 힘과 수소결합 에 의하여 conjugation이 일어났음을 확인할 수 있었다[20]. Figure 3b 는 L-lysine으로 표면개질한 금나노입자이며 1,407, 1,582 cm^-1는 각각 C-O stretching vibration, C=O stretching vibration 피크이며 2,937, 3,342 cm^-1는 각각 C-H stretching vibration과 N-H stretching vibration 피크를 나타내었다. 또한 N-H stretching vibration 피크가 -OH ligand 에 의하여 3,427 cm^-1 피크에서 겹치는 것을 확인할 수 있었다. 이는 AuNP/L-lysine의 표면 관능기는 -NH₂와 -COOH이며 L-lysine의 관능 기들이 AuNP의 -OH, -COOH그룹들과 결합되었음을 보여준다. AuNP 표면에 막으로 형성된 citrate와 L-lysine과의 수소결합과 정전기적인 력에 의하여 conjugation되었음을 확인하였다[21].

Figure 4는 X-ray photoelectron spectroscopy를 이용하여 MUA와 L-lysine으로 기능화된 금나노입자의 표면전자구조를 비교 분석하였 다. Figure 4a는 Turkevich-Frens법으로 제조된 금나노입자이며 C 1s 와 O 1s의 피크가 나타나는 것으로 보아 citrate에 의한 환원반응에 의 하여 금나노입자 표면에 코팅이 되어있음을 나타내었다. Figure 4b는 MUA로 표면개질된 금나노입자의 표면 화학상태를 나타내며, 개질 전의 금나노입자와 비교하여 C 1s와 O 1s 피크 세기가 현저히 증가하 였음을 확인하였다. 또한, high-resolution S 2p 피크가 뚜렷하게 관찰 된 것으로 보아 이는 금나노입자가 MUA로 표면 개질되었음을 확인 하였다. Figure 4c는 L-lysine으로 표면개질한 금나노입자이며 survey scan의 C 1s, O 1s 피크와 high-resolution N 1s 피크가 나타나는 것으로 보아 금나노입자의 표면이 -COOH, -NH₂로 개질되었음을 확인하였다.

표면개질 금나노입자와 항체 간의 접합을 위하여 pH 및 항체의 농 도에 따라 최적화 조건 및 금나노입자의 안정성을 분석하였다. 금나 노입자의 안정성을 위하여 pH와 항체의 농도에 따라 적정된 표면개 질 금나노입자에 10 wt% NaCl 용액을 첨가한 뒤 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Figure 5a는 pH에 따라 적 정된 표면개질 금나노입자를 분석하였으며 pH 7.07에서 가장 낮은 흡 광도를 나타내었으며 항체와의 접합 이후에도 가장 안정적인 분산액 을 나타내었다. Figure 5b는 pH 7.07에서 항체의 농도에 따라 접합된 표면개질 금나노입자를 분석하였으며 10 μg/mL 항체 농도에서 가장 안정적인 conjugation 상태를 나타내었다. AuNP/L-lysine의 경우도 위 와 같은 방법으로 항체와의 conjugation 최적화를 확인하였으며, 실험 결과 pH 7.0과 항체 농도 10 μg/mL에서 가장 안정적인 분산액을 유 지하였다.

기능화된 금나노입자의 면역센서 효과를 관찰하기 위하여 B형간염 표면항원 검출을 위한 측방유동면역분석 스트립 센서를 제작하였다 (Figure 6a). 스트립 센서의 구성요소들로써 cotton 샘플패드, polyester 접합패드, nitrocellulose 멤브레인, cotton 흡수패드 등을 사용하였다. 샘플패드와 흡수패드는 0.4 cm × 1.8 cm, 접합패드는 0.4 cm × 0.6 cm, 멤브레인 0.4 cm × 2.0 cm로 절단한 후 사용하였으며 0.4 cm × 6.0 cm로 절단한 backing card를 back-bone structure로 사용하였다. 측 방유동면역분석 스트립을 제작은 다음 순서대로 제작하였다. 먼저 멤 브레인은 backing card 하단으로부터 2.1 cm 위에 위치하도록 고정하 였다. 접합패드는 고정된 멤브레인의 하단과 겹치는 부분이 0.1 cm가 되도록 부착하였으며 또한 고정된 접합패드 위에 하단과 샘플패드의 겹치는 부분이 0.3 cm가 되도록 부착하였다. 마지막으로 멤브레인 상 단에 흡수패드와 겹치는 부분이 0.4 cm가 되도록 부착하였다. Figure 6a는 완성된 면역 스트립 센서의 구조 모식도를 나타낸다.

다양한 B형간염 표면항원 농도(100 μg/mL~1 ng/mL)에서 면역 스 트립 센서의 test line에서 발색되는 금나노입자의 색상을 관찰함으로 써 센서의 성능을 측정하였다. 기능화가 되지 않은 AuNP기반의 면역 스트립 센서의 경우 검출한계가 100 ng/mL로 확인되었다(Figure 6b). 이에 반해 MUA와 L-lysine으로 표면 개질된 금나노입자 기반의 면역 스트립 센서의 경우 10 ng/mL의 낮은 항원 농도에서도 검출이 될 수 있음을 확인하였다(Figure 6c and 6d). AuNP/L-lysine의 경우 보다 더 밝은 발색이 일어남을 관찰하였다. 이는 L-lysine의 -NH₂와 -COOH의 그룹들이 항체와의 conjugation을 보다 용이하게 하여 면역 스트립 센 서에서 보다 안정적으로 면역반응이 일어날 수 있도록 유도하였기 때 문이다.

4. 결 론

본 연구에서는 MUA와 L-lysine을 이용하여 금나노입자의 표면을 개질하였으며 광학분석 및 표면분석을 수행하였다. 광학분석을 통하 여 표면개질 금나노입자의 흡광도가 낮아짐을 확인하였으며 항체와 의 접합을 위한 최적화 조건으로는 표면개질 금나노입자는 pH 7.07, 항원의 농도가 10 μg/mL일 때 분산액이 가장 안정적으로 나타났다. FT-IR과 XPS 표면분석을 통하여 실제 금나노입자 표면에 MUA 및 L-lysine 작용기로 개질이 되어있음을 확인하였다. B형간염표면항원 분석용 스트립 센서를 제작하여 기능화된 금나노입자의 면역 반응 효 과를 관찰하였으며, 10 ng/mL의 B형간염항원 농도까지 검출될 수 있 음을 확인하였다.